Este protocolo fue desarrollado para proporcionar un método robusto para la medición de la betaoxidación total de ácidos grasos mitocondriales y peroxisomales en hepatocitos primarios de ratón. El uso de células intactas mantiene la integridad de los orgánulos y los mecanismos reguladores en su lugar. Además, el ensayo de hepatocitos recién aislados minimiza los cambios en la expresión génica con respecto al hígado de origen.
La cirugía puede ser un desafío. Tienes que ser confiado, diligente y concentrado. Una vez que la canulación sea exitosa, trate de relajarse, pero preste atención y controle la calidad de la perfusión.
Para comenzar el procedimiento, rocíe generosamente el abdomen y el pecho del ratón anestesiado con etanol al 70%. Luego use los fórceps para levantar la piel y la pared abdominal cerca de la base del abdomen y corte lateralmente a cada lado de la línea media y hasta el diafragma para exponer los órganos. Exponga la vena cava inferior, o IVC, moviendo los intestinos hacia el lado derecho y volteando suavemente los lóbulos del hígado hacia arriba.
Inserte un pequeño objeto cilíndrico, como una tapa de aguja, debajo de la parte posterior del mouse para inclinar ligeramente el IVC y facilitar la canulación. Después de arrancar la bomba con el búfer uno a la velocidad más baja, inserte la aguja en el IVC. Luego corte la vena porta para aliviar la presión y permitir el drenaje de sangre y los tampones de perfusión.
Antes de aumentar el caudal a siete ml por minuto. Perfunda el hígado con tampón caliente uno y asegúrese de que la línea insertada en el tubo que contiene el tampón uno permanezca continuamente sumergida para evitar la introducción de burbujas de aire. Mientras se produce la perfusión, agregue 130 microlitros de solución de colagenasa para amortiguar dos, y mezcle mediante pipeteo con una pipeta serológica.
A medida que el volumen en el tubo que contiene el tampón uno disminuye a aproximadamente cinco ml, agregue lentamente cinco ml del búfer dos para amortiguar uno mediante el pipeteo en el lado del tubo. Repita la adición dos veces antes de agregar los dos tampones restantes al tubo. Detenga la perfusión cuando queden entre 5 y 10 ml de tampón dos en el tubo.
Luego extirpe el hígado y transfiéralo al plato de cultivo de 100 ml que contiene 20 ml de tampón helado dos. Debajo de la capucha de flujo laminar, rompa suavemente el tejido hepático con tijeras quirúrgicas y pinzas. A continuación, agregue aproximadamente 20 ml de tampón M199 helado a la suspensión de hepatocitos y filtre a través de un colador de células de 100 micras utilizando el émbolo de una jeringa para promover suavemente la liberación de hepatocitos adicionales de las piezas hepáticas más grandes.
Lave la placa de cultivo de 100 ml y el colador celular con tampón M199 para recoger la suspensión celular hasta que el tubo de recolección esté lleno. Luego centrifuga la suspensión a 50 x g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante antes de volver a depositar el pellet de hepatocito en 30 mL de frío M199 girando.
Repita el lavado una vez. Descongele las soluciones de ácido palmítico y albúmina sérica bovina, o BSA, antes de preparar la mezcla de sustrato para múltiples reacciones. Alícuota de 13,5 microlitros de solución de BSA por reacción en un tubo de microcentrífuga.
Después de calentar el tubo a 41 grados centígrados, agregue un microlitro de la solución de ácido palmítico de 200 mM por reacción. Vórtice el tubo vigorosamente antes y durante la incubación a 41 grados celsius durante 20 a 30 minutos para facilitar la formación del complejo ácido palmítico soluble-BSA. Durante este tiempo, alícuota 133 microlitros de 1 M de ácido perclórico que se utilizarán para detener las reacciones en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml.
Antes de comenzar las reacciones, alícuota e incuba 485,5 microlitros de tampón M199 por reacción en un tubo a 37 grados centígrados para diluir el complejo radiactivo BSA-ácido palmítico preparado. A continuación, dispense 750 microlitros de M199 con o sin inhibidores en los tubos inferiores redondos separados de 14 ml como muestras. Durante los pasos de lavado de hepatocitos, de 10 a 15 minutos antes de comenzar las reacciones, transfiera los tubos a un baño de agua agitado a 37 grados Celsius a 180 a 200 rotaciones por minuto.
Si la viabilidad de los hepatocitos es de al menos el 75%, complete la preparación de la mezcla de sustrato transfiriendo 0,8 microlitros de ácido palmítico carbono-14 por reacción al tubo de microcentrífuga que contiene la solución clarificada de ácido BSA-palmítico. Vórtice antes de devolver el tubo al baño de agua a 41 grados centígrados. Inmediatamente después de la resuspensión final del hepatocito, transfiera 750 microlitros de la suspensión de hepatocitos a cada uno de los tubos de fondo redondos de 14 ml en el baño de agua agitadora utilizando una pipeta de un ml y vórtice los tubos brevemente a baja velocidad antes de transferirlos a una incubadora, escalonando cada adición en 30 segundos.
Transfiera una alícuota separada de hepatocitos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para girar a 3000 x g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante antes de almacenar el pellet a menos 80 grados centígrados para medir la cantidad total de proteína en la muestra para normalizar los resultados. Mientras los hepatocitos están bajo preincubación a 37 grados centígrados, agregue el complejo radiactivo BSA-ácido palmítico al medio cálido para mantenerse a 37 grados centígrados hasta que esté listo para comenzar las reacciones.
Para iniciar las reacciones, retire los hepatocitos del baño de agua y agregue 500 microlitros de la mezcla de sustrato a los hepatocitos. Vórtice las células a baja velocidad durante cinco segundos antes de volver al baño de agua para incubar durante 15 minutos. Inicie un conjunto de reacciones e inmediatamente deténgase para determinar la radiactividad de fondo.
Transfiera y reserve las alícuotas duplicadas de 200 a 250 microlitros de la mezcla de sustrato sobrante en viales de centelleo de 6 ml para realizar el conteo. Para detener las reacciones, retire los hepatocitos del baño de agua para resuspender mediante vórtice a una velocidad moderada y luego transfiera 400 microlitros de la suspensión de hepatocitos a los tubos de la microcentrífuga que contienen ácido perclórico. Tapar y vórtice inmediatamente los tubos antes de repetir la secuencia para todas las muestras, escalonando en 30 segundos.
Después de girar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 13,000 x g durante 10 minutos, transfiera 300 microlitros del sobrenadante a un vial de centelleo de 6 ml y agregue 4 ml del líquido de centelleo para contar la radiactividad en las muestras y las alícuotas de mezcla de sustrato en un contador de centelleo. En el estudio, la perfusión hepática produjo de 30 a 40 millones de células por hígado, con una viabilidad promedio del 80%También se observó que la disminución de la concentración de glucosa en el grupo de ayuno no tuvo ningún efecto negativo en el rendimiento o viabilidad de los hepatocitos. La suspensión de hepatocitos, aislada de ratones machos alimentados y en ayunas, se ensayó para determinar la capacidad de betaoxidación de ácidos grasos en presencia y ausencia de etomoxir, un potente inhibidor de CPT1 y oxidación de ácidos grasos mitocondriales.
Los recuentos por minuto, o CPM, asociados con la radiactividad de fondo varían con el lote de ácido palmítico. Sin embargo, la CPM todavía era significativamente más baja que las muestras incubadas con la mezcla de sustrato. Los hepatocitos aislados de los ratones en ayunas muestran un aumento robusto en las tasas de betaoxidación de ácidos grasos mitocondriales y peroxisomales.
Los datos se estudiaron más a fondo para determinar la velocidad a la que el ácido palmítico se oxida en los hepatocitos aislados de los ratones alimentados y en ayunas. Evite que las burbujas entren en la línea. Mantenga la aguja estable durante la perfusión.
Sea suave al manipular los hepatocitos. Manténgalos en suspensión al dispensarlos. Los hepatocitos aislados de este procedimiento se pueden utilizar como suspensión para ensayar otras vías metabólicas, como la síntesis de ácidos grasos, o se pueden enchapar para experimentos de cultivo celular.
