Este método ayudará a ilustrar los mecanismos moleculares de un fenómeno biológico multifacético. Como la mecanobiología, la electrofisiología óptica y las imágenes de proteínas de ADN / ARN de superresolución utilizando técnicas automáticas de imágenes de células vivas. Este protocolo permite la corrección automática, multifuncional, de alto rendimiento, autodesvía y adquisición de imágenes a largo plazo.
Es compatible con la mayoría de las plataformas microscópicas fluorescentes, como NYCOM. Cualquiera que pruebe esta técnica por primera vez debe comprender la función de cada paso, en lugar de solo seguir el protocolo estrictamente, para garantizar un experimento exitoso. Comience colocando la cámara de ambiente en la etapa motorizada del microscopio invertido.
Ajuste el caudal de CO2 a 160 mililitros por minuto y ajuste la temperatura de la cámara. Luego agregue 40 mililitros de agua purificada en el baño de la cámara. Saque la placa de Petri con fondo de vidrio con células de la incubadora y colóquela en la cámara de ambiente.
Encienda el controlador confocal y el microscopio invertido. Cambie la trayectoria de la luz a la derecha. Observe las celdas que se conectan mediante Micro Manager.
Si se han unido suficientes células al gel, transfiera la placa de Petri a la incubadora. De lo contrario, continúe la incubación celular durante otros 30 minutos para B2B y 60 minutos para el cáncer de pulmón o las células PC-9. Corta 2 trozos pequeños de cinta adhesiva y pégalos en la cámara alrededor del orificio circular.
Luego aplique un poco de pegamento adhesivo en el área de la cinta que cubrirá la placa de Petri. Saque la placa de Petri de la incubadora. Coloque lentamente la placa de Petri en la cámara y deje que el fondo de la placa haga contacto con el pegamento.
Presione la tapa de la placa de Petri durante 1 minuto para permitir que el pegamento haga contacto completo con la placa de Petri y se solidifique. Empuje suavemente la placa de Petri horizontalmente para asegurarse de que el pegamento se haya solidificado y la placa de Petri no se mueva. Luego cierre la tapa de la cámara.
Abra IntelliJ y establezca un parámetro T1 en la línea 93 del archivo elements_script.java. Asegúrese de que este valor es mayor que el tiempo de ejecución de la macro y los elementos utilizados para la creación de imágenes confocales de un campo de visión. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el proyecto AMFIP IntelliJ.
Haga clic en el botón en vivo y de desaquisición múltiple en la interfaz principal de Micro Manager, luego cambie la trayectoria de luz del microscopio invertido a la derecha para obtener imágenes de campo brillante. Cambie al objetivo de 10 veces y abra la luz LED con la intensidad establecida en 5%Haga clic en el objetivo del microscopio de trayectoria de luz y el botón de la lámpara LED en el panel TI2 de elementos. Ajuste el joystick XY y la perilla del plano Z para encontrar la posición correcta y el plano de enfoque del gel en la placa de Petri.
Utilice el objetivo de 10 veces para encontrar los campos de visión apropiados de múltiples células individuales unidas al gel. Marque la casilla XY de posiciones múltiples en la ventana de adquisición multidimensional. Haga clic en el botón editar lista de posición y observe la ventana de lista de posición del escenario que aparece.
Cambie el objetivo a 40 veces, aumente la intensidad de la luz LED al 15%Reajuste la etapa motorizada XY para ubicar los campos de visión y registre las coordenadas haciendo clic en el botón de marca en la ventana de la lista de posición del escenario. Registre de 6 a 7 campos de visión deseados. Haga clic en el botón Guardar como en la ventana de la lista de posición del escenario para registrar las coordenadas y la entrada T1 como la sección de intervalo de tiempo de la adquisición de imágenes a T1 en la sección de punto de tiempo en la ventana de adquisición multidimensional.
Abra los elementos, cambie la trayectoria de la luz a la derecha para obtener imágenes confocales y apague la luz LED. Luego haga clic en el botón de eliminación de enclavamiento y encienda el canal láser FITC para imágenes YAP marcando la casilla FITC. Después de ajustar la velocidad de escaneo a 1 fotograma por 2 segundos, gire la perilla del plano Z para encontrar la posición Z de las celdas adjuntas rápidamente.
Registre los límites inferior y superior de la pila Z. Haga clic en macro en la cinta superior, seleccione editor de macros en el menú desplegable de macros e introduzca los límites inferior y superior de la pila Z en un archivo de macro. Encienda el canal láser DAPI para la obtención de imágenes de perlas marcando la casilla DAPI para encontrar y registrar la posición Z enfocada de las perlas.
Vaya al editor de macros e introduzca los valores registrados en el archivo de macros. Para configurar la tarea de mover la etapa motorizada usando AMFIP, vaya a Micro Manager, haga clic en automatización de plug-ins para abrir la interfaz gráfica de usuario de AMFIP. Luego haga clic en los botones Agregar punto o quitar punto para adquirir el número exacto de campos de vista seleccionados.
Introduzca las coordenadas registradas de los campos de visión en el panel de coordenadas. Defina el tiempo total del experimento en el campo de texto tiempo total del experimento. Haga clic en el botón de configuración de tiempo adicional y defina el intervalo de tiempo T2 de mover la etapa motorizada a cada FOV.
Maximice el tamaño de la ventana de los elementos y arrastre la GUI de AMFIP al lado derecho de la pantalla para evitar que la GUI perturbe las operaciones automáticas del cursor y luego haga clic en el botón Enter. Después de que termine la primera macro. haga clic en el botón adquirir en la ventana de adquisición multidimensional.
Después de finalizar la imagen a largo plazo, detenga la tarea AMFIP haciendo clic en el botón de pausa en la ventana del complemento de automatización y en el botón de detención en la ventana de adquisición multidimensional. Abra los elementos y configure las imágenes de la pila Z haciendo clic en los botones superior e inferior en la ventana de adquisición de ND. Cambie la trayectoria de la luz a la derecha y abra la luz LED.
Retire lenta y cuidadosamente las tapas de la cámara y la placa de Petri mientras monitorea la vista de campo brillante para detectar cualquier deriva del campo de visión. Use una pipeta de plástico para tomar 0,5 mililitros de solución SDS. Sostenga cuidadosamente la pipeta de plástico un poco por encima del medio de cultivo en la placa de Petri y agregue de 1 a 2 gotas de la solución SDS en el medio de cultivo.
Una vez que las celdas y la vista de campo brillante estén disueltas, cierre la luz LED, cambie la trayectoria de la luz hacia la izquierda, haga clic en el botón Eliminar enclavamiento. Ejecute la imagen de la pila Z y guarde la pila de imágenes como reference_N, donde N es el número de secuencia de cada campo de visión. Haga clic en el botón XY de posiciones múltiples en la ventana de adquisición multidimensional.
Luego seleccione el siguiente campo de visión y haga clic en el botón de ir para mover la etapa motorizada al segundo FOV. Repita este paso para cada campo de visión. La localización nuclear es de proteína asociada al sí o YAP en elfos B2B aumentados con el aumento de la rigidez del sustrato, mientras que las células PC-9 mostraron una concentración similar de YAP en el núcleo y el citoplasma en sustratos de rigidez variable.
La célula B2B aumentó monótonamente el área de propagación con el tiempo, junto con una disminución en la proporción nuclear a citoplasmática de YAP, mientras que la célula PC-9 mantuvo un área de propagación celular comparativamente inmutable, orientación y relación nuclear a citoplasmática de YAP a lo largo del proceso de propagación de 10 horas. Durante las 10 horas de duración de la propagación temprana, la célula B2B representativa deformó constitutivamente la superficie del sustrato y aplicó la tracción celular evolutiva en todo el área celular. En contraste, la célula PC-9 representativa solo desarrolló desplazamiento y tracción en los 2 extremos del cuerpo celular, y su tracción disminuyó después de 7.5 horas.
La relación nuclear a citoplasmática YAP y la tracción dipolar de las células B2B parecían seguir dos tendencias distintas, lo que sugiere que podría haber habido dos grupos de células B2B que coexistieron en el experimento. En el primer grupo, la relación nuclear a citoplasmática YAP y la tracción dipolar aumentaron junto con el agrandamiento del área de propagación celular y alcanzaron sus máximos en aproximadamente 1.000 micrómetros cuadrados. En el segundo grupo, la relación nuclear a citoplasmática YAP y la tracción dipolar aumentaron a un ritmo más lento con el agrandamiento del área de propagación celular y mantuvieron valores casi constantes cuando el área de propagación celular continuó aumentando.
Los rangos de pila Z para todos los canales láser deben determinarse cuidadosamente para superar la deriva potencial del campo de visión durante el movimiento de la etapa en imágenes a largo plazo. Esta novedosa técnica permite imágenes automáticas, no invasivas a largo plazo y multiposición, y puede ayudar a dilucidar el mecanismo de biología molecular que requiere el seguimiento temporal y espacial de células y orgánulos.
