Las células madre mesenquimales derivadas de la almohadilla de grasa infrapatelar, o en resumen, IFP-MSC, son un tipo de células madre relativamente menos estudiado. Este protocolo es un método simple, confiable y reproducible que demuestra el aislamiento de IFP-MSC de la articulación de sofocación de cabra. La principal ventaja de la técnica es que se puede obtener una gran cantidad de IFP-MSC de alta calidad.
Los IFP-MSC aislados pueden diferenciarse en múltiples linajes y poseen un amplio potencial regenerativo. Debido a su ubicación anatómica, los IFP-MSC han ganado interés en reparar defectos del cartílago y aliviar la degradación del cartílago en la osteoartritis. El método tiene implicaciones para la terapia basada en células en el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.
El procedimiento para el aislamiento, expansión y diferenciación de IFP-MSC será demostrado por el Dr. Sugata Hazra y el Sr. Aman Mahajan. Para comenzar el aislamiento de las células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar, o IFP-MSC, recolecte las articulaciones femorotibiales de cabra que abarcan alrededor de 15 centímetros de las regiones femoral y tibial de las extremidades posteriores en una caja de muestras de recolección esterilizada. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados para transportarla al laboratorio para su posterior procesamiento.
Coloque la muestra en una placa de Petri de 150 milímetros y asegúrese de procesar la muestra asépticamente y en un gabinete de bioseguridad durante todo el procedimiento. Enjuáguelo bien con PBS esterilizado en autoclave complementado con antibióticos. Mantenga la muestra hidratada usando PBS.
Examine cuidadosamente las regiones anatómicas de la muestra. Para facilitar el acceso, retire los tejidos adicionales de ambos huesos largos por completo sosteniendo la superficie final del hueso del fémur con una mano y cortándola longitudinalmente hacia la articulación con tijeras afiladas. Luego, sin alterar el tejido que rodea la cápsula articular, retire los músculos y el tejido adiposo del hueso.
Del mismo modo, haga otra incisión en el extremo tibial de la muestra y retire los músculos y el tejido adiposo del hueso tibial. Asegúrese de que ambos huesos largos estén completamente expuestos y que la cápsula articular sea visible. Luego, haga una incisión desde cada lado de la membrana sinovial para abrir la articulación articulada.
Cortar la rótula de la membrana sinovial y los ligamentos rotulianos con tijeras y fórceps recién esterilizados. Coloque inmediatamente la rótula separada en una placa de Petri que contenga PBS. De la rótula separada, retire toda la almohadilla de grasa presente en la superficie interna con tijeras y pinzas.
Recógelo en otra placa de Petri fresca y picócalo con un bisturí. Incluye otras herramientas quirúrgicas para obtener los pequeños segmentos de grasa de alrededor de dos a tres milímetros. Use una espátula para transferir el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y lávelo tres veces con PBS suplementado con antibióticos durante 15 minutos a temperatura ambiente usando un mezclador de tubo de ensayo.
Para la digestión enzimática, incubar alrededor de cinco gramos del tejido picado en Dulbecco's Modified Eagle Media, o DMEM, medios bajos en glucosa que contienen 1,5 miligramos por mililitro de colagenasa tipo II y 2% FBS a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Aspire cuidadosamente el tejido digerido y fílelo a través de un colador de células de 70 micras para eliminar cualquier parte no digerida. Centrifugar el filtrado en un tubo de centrífuga de 15 mililitros a 150 veces g durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante antes de lavar el pellet celular con DMEM bajo en glucosa dos veces. Vuelva a suspender el pellet en DMEM completo, también conocido como medio de expansión. Sembrar las células en una placa de Petri de 150 milímetros y cultivarlas en los medios de expansión suplementados con cinco nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico, o BFGF, y 50 microgramos por mililitro de sal trisódica de ácido 2-fosfo-L-ascórbico.
Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% para permitir que las células se adhieran y proliferen. Controle la unión y el crecimiento de las células diariamente. Para un correcto mantenimiento y expansión de los IFP-MSCs, cambie los medios cada tres días.
Mientras cambia el medio, agregue cinco nanogramos por mililitro BFGF y 50 microgramos por milímetro de sal trisódica de ácido 2-Phospho-L-ascórbico directamente a la placa de Petri. Una vez que las células se vuelven 80% a 90% confluentes, subcultivarlas eliminando los medios de expansión de la placa de Petri y lavando las células con 1X PBS. Luego agregue cuatro mililitros de 0.25% de tripsina-EDTA al plato e incube las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.
Después de cuatro minutos, golpee la placa de lado para desalojar las celdas. Confirme el desprendimiento completo de todas las células bajo un microscopio. Una vez confirmado, agregue un volumen igual de medios de expansión para neutralizar la tripsina.
Use una pipeta para recoger estas células disociadas en un tubo fresco de polipropileno de 15 mililitros y centrifugarlas a 150 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el volumen deseado de medios de expansión. Cuente las células utilizando el método estándar de conteo de células y subcultive para una mayor expansión a una densidad de siembra de 10, 000 células por centímetro cuadrado en una placa de Petri de 150 mililitros.
Para todos los ensayos, utilice una monocapa confluente de células de paso número P2 a P5. Cuando las células expandidas alcancen una confluencia del 80% al 90%, disocie las células usando solución de tripsina-EDTA antes de peletizarlas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros a 150 veces g durante cinco minutos. Luego resuspender el pellet en plasma de cabra a una densidad de 2 millones de células por 50 microlitros. Agregue 50 microlitros de plasma que contengan las células en una placa de Petri esterilizada de 90 milímetros, seguida de la adición de cloruro de calcio a una concentración final de 0.3%Mezcle bien para fabricar hidrogel de plasma reticulado.
Después de incubar el hidrogel fabricado a 37 grados centígrados durante 40 minutos, transfiera los hidrogeles a placas de cultivo de tejido de 24 pocillos que contengan medios condrogénicos. Cambie los medios cada tres días durante 14 días. Los hidrogeles cultivados en medios DMEM completos sin TGF-beta 1 se consideran controles no inducidos.
Después de 14 días de diferenciación condrogénica de células en hidrogel plasmático, lave los hidrogeles tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno y fije las muestras en formalina tamponada neutra durante tres horas. Las IFP-MSC aisladas fueron homogéneamente adherentes y alcanzaron una morfología alargada dentro de las 24 horas del cultivo in vitro. Las células proliferaron eficientemente entre el 80% y el 90% de confluencia dentro de los seis días de expansión y mostraron capacidad clonogénica, lo que indica capacidades proliferativas y de autorenovación eficientes.
Cuando se trataron para diferenciarse en linaje adipogénico, las células aisladas produjeron gotas de lípidos, lo que se confirmó mediante la tinción Oil Red O en los días 14 y 21. Tales gotas de aceite no eran visibles en las células sin factores inductores adipogénicos. Las células aisladas encapsuladas en hidrogel plasmático mostraron que la formación de neotejido blanco y brillante después de 14 días en el grupo inducido mostró el potencial condrogénico.
El grupo no inducido tenía tejido blanco pálido con brillo reducido. Además, la tinción histológica positiva para el azul de Alcian y la safranina O en el grupo inducido indicó que las células podrían secretar glicosaminoglicanos sulfatados, uno de los principales componentes de la matriz del cartílago. En contraste, las secciones de hidrogel de los grupos no inducidos fueron negativas para la tinción de Safranina O y Azul de Alciano, confirmando el potencial de diferenciación condrogénica de las células madre mesenquimales solo en presencia de estímulos condrogénicos.
Las células aisladas inducidas con medios osteogénicos mostraron tinción positiva para fosfatasa alcalina, confirmando la mineralización al final de 14 días. Después de 28 días de inducción osteogénica, se observaron las deposiciones calcificadas con tinción Alizarin Red S. Los resultados subrayaron el potencial de diferenciación de las células inducidas en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos.
Es esencial procesar la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación. También es importante identificar la ubicación correcta de la rótula. Este procedimiento abre la vía para aislar varios tipos de células, como condrocitos articulares, fibroblastos de ligamentos y células madre de membrana sinovial y líquido sinovial, teniendo amplias aplicaciones en medicina regenerativa.
Después del aislamiento de IFP-MSC utilizando esta técnica, su efectividad se investigó particularmente para la regeneración de tejidos musculoesqueléticos, como cartílago, hueso y ligamento utilizando enfoques sin andamios y andamios.
