Nuestro protocolo demuestra que el ECM puede promover la diferenciación adipogénica en ausencia de mediadores adipogénicos clásicos y es el primero en demostrar la regulación específica de la enfermedad del metabolismo celular por el ECM. Nuestra técnica proporciona una herramienta para diseccionar las funciones del ECM y los adipocitos en el metabolismo del tejido adiposo y permitir el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo. En comparación con el cultivo celular 2D estándar, nuestro modelo 3D permite un examen más robusto y la disección de las conversaciones cruzadas entre los adipocitos y el ECM del tejido adiposo en el contexto de la diabetes tipo 2.
Recomendamos comenzar con muestras más pequeñas para medir qué tan bien está celularizado. Tenga en cuenta que hay variabilidad interpatricial en cómo crecen las células y qué tan bien se descelulariza el tejido. Es importante observar el tejido antes y después de cada paso para asegurarse de que el tejido se está descelularizando y para entender las posibles diferencias entre las muestras.
Después de obtener tejido adiposo visceral o IVA de la cirugía, prepararlo para el almacenamiento mediante la adición de 5-10 gramos del tejido a 15-25 mililitros de solución tampón de congelación en un tubo cónico de 50 mililitros. Sumerja completamente la muestra y guárdela a menos 80 grados Centígrados hasta la descelularización. Para el aislamiento de preadipocitos, coloque dos gramos de una muestra fresca de IVA intacto en 20 mililitros de solución de colagenasa tipo II, luego inserte tijeras estériles en el tubo y picar a fondo el tejido.
Una vez picado a una lechada fina, incubarlo en la solución de colagenasa a 37 grados Centígrados en un agitador orbital durante 60 minutos. Después de la incubación, filtre el resultante digerido a través de una malla de nylon de 100 micrómetros en un tubo cónico fresco de 50 mililitros. El digerido debe ser un líquido amarillo-naranja con viscosidad moderada y una pequeña cantidad de hebras residuales de tejido no digerido.
Centrifugar la muestra a 270 veces g durante 10 minutos, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en dos mililitros de solución de lisiones RBC 1X con una pipeta. Incubar la solución durante un minuto a 25 grados centígrados, luego añadir 10 mililitros de 15%FBS DMEM F12 y centrifugarlo a 270 veces g durante 10 minutos. Para preparar el ECM, congele/descongele la muestra de IVA previamente congelada a 37 grados centígrados incubando en un baño de agua precalentado durante 20 minutos con agitación manual suave y periódica.
Una vez descongelado, transfiera el tejido de nuevo a menos 80 grados Celsius durante 20 minutos y repita el proceso de congelación/descongelación tres veces terminando con el descongelación. Utilice fórceps estériles para transferir la muestra de IVA a un tubo cónico fresco de 50 mililitros que contenga 15-25 mililitros de solución enzimática 1 asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida. Luego incubar durante la noche a 37 grados celsius mientras se agita a 130 RPM.
Al día siguiente, lave la muestra tres veces con 15-25 mililitros de solución tampón de enjuague, vertiendo la solución después de cada lavado. Transfiera la muestra a un tubo fresco de 50 mililitros con 15-25 mililitros de solución enzimática 2 y incubarlo durante la noche. Repita los lavados con la solución tampón de enjuague y transfiera la muestra a un tubo fresco que contenga 15-25 mililitros de solución de extracción de disolvente polar.
Incubar la muestra durante la noche mientras se agita. Después de la incubación con la solución de disolvente polar, es importante examinar la muestra para la eliminación de lípidos. Si no se elimina la mayor parte del lípido, puede ser necesario repetir este paso.
Se puede utilizar un tiempo de incubación más corto. Después de la incubación, transfiera la muestra a un tubo fresco que contenga 15-25 mililitros de solución tampón de enjuague y lave la muestra tres veces en la coctelera. A continuación, lave la muestra tres veces con una solución de etanol al 70%, vertiendo el etanol después de cada lavado.
Lave la muestra una vez con la solución de almacenamiento y, a continuación, utilice fórceps estériles para transferirla a un tubo nuevo que contenga 15-25 mililitros de solución de almacenamiento asegurándose de sumergirla completamente. La muestra se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un mes. El isopropanol y el etanol son inflamables y deben estar a temperatura ambiente y desecharse en residuos inflamables.
Los residuos humanos deben eliminarse por separado de los residuos biopeligos habituales. Transfiera los fragmentos de ECM almacenados a pozos individuales de una placa de 24 pocillos con fórceps estériles añadiendo tantos fragmentos como sea necesario para los ensayos posteriores planificados. Lávelos tres veces con 500 microlitros de 70% de etanol en un agitador orbital, luego rehidratarlos lavándolos tres veces con PBS.
Utilice tijeras estériles para cortar el ECM en fragmentos de 100 miligramos. Coloque cada fragmento en un pozo de una placa de 24 pozos e incubar la placa a 25 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que el exceso de PBS extruya de los fragmentos. A continuación, retire cuidadosamente cualquier PBS sobrante de los pozos con una pipeta.
Siembra cada fragmento con 20 microlitros de suspensión celular de preadipocitos pipeteando las células directamente en el ECM. Coloque la punta de la pipeta en el ECM y expela suavemente en el centro de la matriz asegurándose de que la suspensión de la célula no se desborde y termine en la parte inferior del pozo. Si la suspensión de la celda se desborda desde el ECM, retire la punta de la pipeta de esa ubicación e insértela en otra parte del ECM.
Después de la siembra celular, incubar el ECM durante 40 minutos a 37 grados centígrados. Llene cada pozo con 500 microlitros de medios de crecimiento para cubrir los fragmentos de ECM sin semillas. Cultivo de las células a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 72 horas.
Después de 72 horas, aspira cuidadosamente los medios de crecimiento sin alterar el fragmento de ECM. Añadir 500 microlitros de medios de diferenciación y cultivar las células durante 14 días cambiando los medios cada dos a tres días. Compruebe la diferenciación mediante microscopía de luz.
Las células acumularán lípidos, se volverán de color marrón-amarillo y se volverán más esféricas a medida que se diferencian. La preparación del ECM del tejido adiposo, la siembra con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros se monitorizaron con microscopía electrónica de barrido que reveló la decelularización del ECM y la posterior recapitulación de lípidos que contienen adipocitos tras la resembración y diferenciación. El colágeno 1 inmunohistoquímica específica de ECM decelularizado mostró mantenimiento de la microarquitectura de colágeno, mientras que la tinción de aceite rojo-O de construcciones de ECM-adipocitos 3D vivos y fijos mostró lípidos que contienen adipocitos.
Los adipocitos diferenciados en ECM se examinaron para detectar genes adipogénicos utilizando PCR cuantitativa en tiempo real, lo que demostró que estos genes están regulados al alza en las células diferenciadas en relación con los preadipocitos indiferenciados cultivados en ECM. Se muestra la diferencia completa en los niveles de transcripción. Cuatro combinaciones de ECM y adipocitos de sujetos diabéticos y nondiabéticos fueron sometidos a fenotipado metabólico.
La absorción de glucosa deteriorada en la función lipolítica se descubrió en construcciones de tejidos diabéticos. Es importante destacar que se encontró que el ECM no ndiabético rescata la absorción de glucosa estimulada por insulina y la capacidad lipolítica en adipocitos diabéticos. La contaminación de los preadipocitos aislados, el tejido decelularizado y el ECM reseedado no es infrecuente.
La esterilidad debe mantenerse diligentemente a lo largo del protocolo.
