Esta técnica es importante porque puede medir la absorción de glucosa en células específicas en tejidos vivos de Drosophila. El sensor basado en FRET proporciona una medida directa de los cambios en los niveles intracelulares de glucosa. Esta técnica permite a los investigadores evaluar los cambios en los niveles de glucosa en tiempo real, dentro de las neuronas motoras vivas a partir de modelos de ELA versus controles.
Un aspecto desafiante es obtener imágenes del mismo conjunto de neuronas después de cambiar el búfer. Dejar la muestra en el microscopio ayuda a garantizar que el VMC se mueva lo menos posible. Antes de comenzar las disecciones, encienda el microscopio de imágenes y los láseres.
Luego recoja una tercera larva errante de instar, enjuáguela con agua destilada doble y colóquela en una gota de tampón HL3 en un plato forrado de elastómero previamente preparado. A continuación, bajo un microscopio de disección, use un par de fórceps para fijar los extremos anterior y posterior de la larva, del lado dorsal hacia arriba, estirando cuidadosamente la larva a lo largo con alfileres de insectos. Usando un par de tijeras Iris en ángulo, haga una incisión justo encima del pasador posterior.
Luego haga un corte vertical desde la incisión hacia el extremo anterior de la larva. Después de agregar unas gotas de tampón HL3 si es necesario, retire la tráquea y el resto de los órganos flotantes sin perturbar el sistema nervioso central. Luego fije las solapas, estirando la pared del cuerpo para exponer el sistema nervioso central mientras mantiene intacto el sistema neuromuscular.
Para la adquisición de imágenes, use un microscopio confocal vertical con una lente de inmersión en agua 40 veces mayor. A continuación, seleccione el láser de 405 nanómetros para excitar el CFP. A continuación, optimice los parámetros de adquisición, como la velocidad de escaneo, el promedio, el objetivo, el tamaño estenopeico del zoom y la resolución espacial.
Ajuste la ganancia de tal manera que la señal esté en el rango dinámico óptimo y use los mismos parámetros para todos los genotipos. Para obtener imágenes de las neuronas motoras dentro del cordón nervioso ventral, coloque la placa de silicona con la muestra diseccionada debajo de la lente y baje la lente para que entre en contacto con el tampón HL3 de sacarosa trehalosa. Asegúrese de que la lente esté completamente sumergida en el búfer y agregue más búfer si es necesario. Próximo.
Utilizando los canales CFP y FRET, seleccione manualmente una selección óptica que consista en al menos seis neuronas motoras enfocadas ubicadas a lo largo de la línea media del cordón nervioso ventral. A continuación, adquiera imágenes cada 10 segundos durante 10 minutos. Estas imágenes representan la línea de base.
Para la estimulación de la glucosa, retire la sacarosa trehalosa que contiene el tampón HL3 usando una pipeta Pasteur y agregue cinco tampón HL3 suplementado con glucosa milimolar sin mover el cordón nervioso ventral. Luego adquiera imágenes cada 10 segundos durante otros 10 minutos. Estas imágenes representan la fase de estimulación.
Guarde las imágenes como archivos CZI o cualquier tipo de archivo compatible con el software de imágenes con un nombre de archivo que incluya la fecha, los antecedentes genéticos, la condición experimental y los canales utilizados. Reutilice los parámetros para obtener imágenes de todos los genotipos. Para el procesamiento de imágenes, abra el software de imágenes Fiji-ImageJ, luego abra los archivos CZI, elija view stack con hyper stack y configure el modo de color en escala de grises y seleccione dividir los canales en ventanas separadas. Próximo.
Procese las imágenes utilizando plug-ins de corrección de deriva, turbo reg y stack reg. Cada canal se corrige por separado seleccionando stack reg en plug-ins y, a continuación, eligiendo transformación a traducción. Elija manualmente las regiones de interés o ROI rastreando todas las neuronas motoras que permanecen enfocadas durante toda la serie de tiempo.
Luego use el administrador de ROI para guardar cada contorno de neurona motora. Utilice la función de medición múltiple para medir el valor gris medio en cada ROI en cada punto de tiempo. A continuación, copie los ROI trazados desde el primer canal hasta el segundo canal para la imagen previa a la estimulación.
Para el análisis de los datos, calcule la relación FRET por CFP utilizando los valores grises medios para los canales FRET y CFP. Los cambios en el FRET por las relaciones CFP reflejan alteraciones en la concentración intracelular de glucosa. A continuación, trace FRET por cfp ratios para cada ROI y punto de tiempo frente al tiempo.
Se utilizó un sensor de glucosa basado en FRET codificado genéticamente para medir la absorción de glucosa en las neuronas motoras. Cuando la glucosa no está unida al sensor, la excitación cfp solo causa emisión de CFP. Y cuando la glucosa se une, la señal YFP se puede detectar debido a fret que ocurre entre CFP y YFP.
Aquí se muestran imágenes de señales FRET y CFP en controles de sensores de glucosa en neuronas mutantes TDP-43 en condiciones basales y de estimulación. Una neurona motora representativa se describe en cada imagen como un ejemplo de ROI. Tras la estimulación de la glucosa, las neuronas motoras de control que expresan sensores de glucosa, exhiben un pequeño aumento en la absorción de glucosa, mientras que las neuronas que expresan TDP-43 mostraron una absorción de glucosa significativamente mayor.
Las proporciones adicionales de FRET por CFP de las neuronas motoras mutantes TDP-43 se normalizaron a los controles del sensor de glucosa en cada punto de tiempo. En condiciones basales, no hubo diferencias entre los genotipos. Sin embargo, tras la estimulación de la glucosa, se observó un aumento rápido y significativo en la absorción de glucosa en los mutantes TDP-43 en comparación con el control.
En una representación de gráfico de barras, la estimulación de la glucosa en las neuronas que expresan el sensor de glucosa demostró un aumento pequeño pero significativo en la relación FRET por CFP en comparación con la línea de base. En contraste, las neuronas que expresan TDP-43 mostraron un aumento significativo en la proporción tras la estimulación en comparación con la línea de base. La diferencia neta en FRET por las relaciones CFP entre las neuronas motoras que expresan TDP-43 y el sensor de glucosa es de alrededor del 10,9%La gestión del tiempo es crítica para este procedimiento para que las neuronas no mueran en el transcurso de la imagen.
Es importante obtener imágenes inmediatamente después de las disecciones para evitar esto. Esta técnica destacó la importancia del metabolismo de la glucosa en las neuronas y ha llevado a nuestro grupo a investigar más a fondo el papel de la glucólisis en la regeneración de las neuronas motoras.
