Por lo tanto, este protocolo nos permite inducir transiciones de fase patológicas de TDP-43 y abordar su consecuencia celular en las neuronas motoras espinales in vivo, lo cual es relevante para comprender por qué las neuronas motoras degeneran en la ELA. Debido a la alta transparencia de las larvas de pez cebra, las neuronas motoras en la médula espinal son directamente visibles. Por lo tanto, se puede visualizar el comportamiento dinámico de TDP-43 que experimenta transiciones de fase en neuronas motoras espinales individuales.
Este método ofrece un nuevo modelo animal de ELA. Creemos que cualquier método que pueda prevenir la transición de fase y la agregación de TDP-43 inducida por la luz en este modelo de ELA puede ser un candidato potencial para la terapia de la ELA. Otras proteínas relacionadas con la ELA con regiones intrínsecamente desordenadas se pueden expresar para explorar la neurotoxicidad asociada con las transiciones de fase anormales.
La clave del éxito en este enfoque es expresar el TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales a nivel no tóxico. La transgénesis BAC es un paso que consume mucho tiempo, pero una vez que crea un pez transgénico adecuado, los siguientes pasos son relativamente más fáciles y directos. Para comenzar, encienda el diodo emisor de luz, o panel LED, utilizando la aplicación asociada instalada en una tableta o teléfono.
A continuación, coloque la sonda del espectrómetro en un pozo vacío de un plato de 6 pocillos. Luego, usando la aplicación, ajuste la luz LED a una longitud de onda que alcance un máximo de 456 nm. Coloque el sensor óptico de un medidor de potencia óptica en el pozo vacío y ajuste la potencia de la luz LED.
Luego coloque el plato con el panel LED en una incubadora a 28 C.Para obtener imágenes de las larvas de peces cebra que expresan TDP-43 optogenético, descorionato los peces doblemente transgénicos y anestéselos en un tampón E3 que contenga 250 g / ml de tricano. A continuación, precaliente la agarosa a baja temperatura de fusión al 1% que contiene 250 g / ml de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato a 42 C.Luego coloque una gota de agarosa en el plato base de vidrio. El diámetro de la gota de agarosa en forma de cúpula en el plato de vidrio debe ser de 8 a 10 mm.
A continuación, con una pipeta Pasteur, agregue el pescado anestesiado a la agarosa en el plato a base de vidrio. Minimice la cantidad de tampón E3 agregado a la agarosa junto con los peces. Luego, mezcle pipeteando un par de veces.
Durante la solidificación de la agarosa, mantenga el pez de lado usando una aguja de jeringa, de modo que la médula espinal esté en una posición horizontal adecuada. Después de que la agarosa se haya solidificado, agregue un par de gotas de tampón E3 sobre el pez montado en agarosa en forma de cúpula. Utilizando un microscopio confocal equipado con una lente de objetivo de inmersión en agua 20 veces, adquiera secciones z confocales en serie de la médula espinal.
Incluya la cloaca en el lado ventral del pez en las regiones de interés como referencia para identificar y comparar los segmentos espinales a través de los puntos de tiempo. Tan pronto como se complete la imagen, use una aguja de jeringa para romper cuidadosamente la agarosa y retirar el pescado de la agarosa. Mantenga la cantidad de tiempo que el pez está incrustado en la agarosa lo más corto posible, aunque la incrustación de agarosa durante menos de 30 minutos no afecta la viabilidad del pez.
Agregue 7.5 ml de tampón E3 a un pozo de un plato de 6 pocillos y coloque el pescado doble transgénico fotografiado en ese pozo. Luego, coloque el plato en el panel LED, manteniendo el plato y el panel LED separados 5 mm con un espaciador, y encienda la luz LED azul. Mantenga un poco de pescado doble transgénico en un plato separado de 6 pocillos cubierto con papel de aluminio para peces de control no iluminados.
Después del tiempo de iluminación deseado, tome imágenes de la médula espinal de los peces iluminados como se demostró anteriormente. La reubicación citoplasmática del opTDP-43h en neuronas motoras espinales individuales se visualizó separando las imágenes de la serie z adquiridas a los 48 años. y 72 horas después de la fertilización en cada canal EGFP-TDP-43z y opTDP-43h.
A partir de imágenes de proyección de máxima intensidad de EGFP-TDP-43z, una sola neurona espinal aislada identificable en ambos 48. y se seleccionaron 72 horas después de la fecundación. Las regiones de interés que cubren los somas de las neuronas motoras se establecieron trazando el borde de la señal EGFP en 48.
y 72 horas después de la fecundación. Se trazó la intensidad fluorescente normalizada a lo largo del eje principal del soma. Y a las 48 horas después de la fertilización, los patrones de ambas señales se superponían en gran medida entre sí.
En contraste, a las 72 horas, el pico de la señal opTDP-43h se encontró en la región donde la señal EGFP-TDP-43z era baja, lo que indica la reubicación citoplasmática de opTDP-43h. Para cuantificar las señales opTDP-43h y EGFP-TDP-43z antes y después de la estimulación de la luz azul, se produjeron algunas imágenes de proyección de cortes para cada canal de las mismas imágenes de la serie z a 48. y 72 horas después de la fecundación.
De las cuatro células mnr2b+ que se investigaron, la célula 1 mostró notablemente una señal saturada de EGFP-TDP-43z. Las cantidades relativas de opTDP-43h a EGFP-TDP-43z se calcularon dividiendo el valor de RFP por el valor de GFP. Las celdas 2 a 4 mostraron niveles decrecientes de opTDP-43h después de la iluminación con luz azul.
Es importante minimizar el tiempo que los peces están incrustados en la agarosa para mantenerlos sanos. Al ajustar la intensidad y la duración de la iluminación LED, controlamos la transición de fase TDP-43 de una manera regulada temporalmente, lo que puede ayudar a diseccionar la progresión de la transición de fase patológica de TDP-43 en la neurona motora.
