Los autores desean agradecer al Dr. Charles Luetje para la prestación del T-laberinto y la sala de conducta. Este trabajo es apoyado por la American Heart Association (para YA), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares subvención R01NS64269 (a RGZ) y el Pew Charitable Trust (a RGZ).

1. Introducción En este vídeo, se muestran dos ensayos de comportamiento con Drosophila para demostrar la medición de la locomoción y las funciones de aprendizaje y la memoria que están comprometidos en las enfermedades neurodegenerativas. En primer lugar, vamos a mostrar cómo el comportamiento del aparato locomotor se puede medir mediante el ensayo de geotaxis negativo. En segundo lugar, vamos a evaluar las capacidades de aprendizaje y la memoria con moscas positivamente fototácticas que son entrenados para asociar la luz con un sabor desagradable amargo y ponerlas a prueba 6 horas más tarde para evaluar las funciones de memoria. Por último, se discutirán las implicaciones y limitaciones de estos ensayos de comportamiento. 2. Equipos y Reactivos <ol><li> Mosca de trabajo <ul><li> Alcance estéreo (Zeiss) </li><li> Pinceles de pintura para empujar las moscas </li><li> Drosophila de dióxido de carbono (CO 2) aparatos de anestesia (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Ensayo geotaxis negativo <ul><li> 28,5 x 95 mm de poliestireno Vial (Vial del Capitolio, Inc.) </li><li> Mini-alarma del temporizador / cronómetro (VWR International) </li><li> Sharpie plumas </li><li> Cinta adhesiva </li></ul></li><li> Aversivo Phototaxis ensayo de supresión <ul><li> Clorhidrato de quinina (Sigma Aldrich, Número CAS: 6119-47-7) </li><li> Agua destilada </li><li> Balanza digital de medición precisos para la dilución en peso </li><li> Conectores de desconexión rápida, Polietileno de Alta Densidad (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> 15 ml tubo de centrífuga (VWR International), corte en la marca de 2 ml de extremo cerrado para encajar con el adaptador de conector de desconexión rápida para la fuente de luz </li><li> De un solo canal 200 pipeteador l para cargar la solución de quinina en papel de filtro de la cámara de revestimiento </li><li> T-Maze (Simple sistemas de comportamiento; Figura 1) </li><li> Papel de aluminio </li><li> Fuente de luz (Zeiss) </li><li> Una lámpara con luz roja. </li><li> El filtro de papel </li><li> Mini-alarma del temporizador / cronómetro (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Preparación de las Moscas <ul><li> Las moscas se mantienen en el nivel de harina de maíz-agar-melaza-levadura medio a 25 ° C en 12 horas de luz / oscuridad ciclo. </li><li> Moscas de la Virgen se encuentran aisladas bajo anestesia de dióxido de carbono en el día de la eclosión. Para los estudios de envejecimiento, las moscas se mantienen en grupos de veinte por vial y se transfiere a un vial de nuevo cada 3 días. Es importante la utilización de moscas hermanos de la misma cruz de los padres para estudios de envejecimiento, para minimizar las diferencias derivadas de las bases genéticas. </li><li> Tanto para los ensayos, las moscas son sexuados y mantenidos en grupos de diez moscas por vial. La diferencia de género en el comportamiento es importante y es aconsejable no mezclar las moscas macho y hembra en un estudio que los datos pueden ser difíciles de interpretar y reproducir 6. </li><li> Para el ensayo geotaxis negativo, las moscas se clasifican en grupos de diez por vial y probado una hora después de la anestesia. Es importante para que las moscas se recuperan completamente de la anestesia ya que esto podría tener un efecto sobre las actividades del aparato locomotor. </li><li> Para el ensayo de APS, las moscas de cada grupo se coloca en un frasco de poliestireno vacío con agua papel de filtro humedecido durante seis horas antes del ensayo se lleva a cabo. Esto asegura que las moscas son muertos de hambre antes de la prueba y será más perceptiva al gusto desagradable. Justo antes del ensayo se realiza, cada mosca de un grupo de diez se coloca en un tubo de centrífuga de 15 ml vacío, que es el máximo libremente, para evitar el escape. </li></ul> 4. Ensayo geotaxis negativo <ul><li> Geotaxis se mide generalmente de diez a veinte grupos de diez individuos del mismo genotipo o el tratamiento (100-200 moscas total de cada genotipo / tratamiento) 7. Grupos de clase de diez moscas hembra o macho en un aparato de anestesia de CO 2 y el lugar de cada grupo en un vial separado. Deje por lo menos una hora de las moscas para recuperarse de la anestesia. </li><li> Preparar el aparato de escalada para cada grupo, de tal manera que dos frascos de poliestireno vacío verticalmente unidas por cinta uno frente al otro. Es importante asegurarse de que las aberturas de los viales están perfectamente alineados entre sí para proporcionar una superficie plana de escalada para las moscas. </li><li> Para el vial inferior, medir una distancia vertical de 8 cm por encima de la superficie del fondo y marcar cada vial dibujando un círculo alrededor de la circunferencia completa del vial. </li><li> La transferencia de un grupo de diez moscas en el vial inferior con cuidado evitando el escape de cualquier mosca. Cubrir inmediatamente el vial inferior con el vial superior y la cinta de seguridad cerca de las aberturas de contacto. Permitir a las moscas para aclimatarse a la nueva configuración de 1 minuto antes de realizar el ensayo. </li><li> Golpee suavemente las moscas a la parte inferior del vial y medir el número de moscas que se puede subir por encima de la marca de 8 cm por 10 segundos después de la llave. </li><li> Repita esta prueba para el mismo grupo diez veces, lo que permite un período de minuto de descanso entre cada prueba. </li><li> Anote el número de moscas por grupo que superó la marca de 8 cm comoporcentaje de moscas total. </li></ul> 5. Aversivo Phototaxis ensayo de supresión (APS Ensayo) Originalmente adaptado de Le Bourg y Buecher (2002) 4, este ensayo explota el comportamiento positivo en fototácticas vuela a entrenarlos para asociar la luz con el estímulo aversivo (en este caso, el sabor amargo de la quinina). Después de una fase de entrenamiento / acondicionado, moscas de tipo salvaje será capaz de asociar la zona iluminada con un gusto desagradable y evitarla. Moscas con la capacidad de aprendizaje comprometida a dejar de hacer esta asociación. Además, el ensayo de APS también se puede utilizar para medir la función de memoria a corto plazo de las moscas de 5 sometiendo ya vuela entrenados para la misma prueba 6 horas después de acondicionamiento para poner a prueba su capacidad para recordar la tarea de aprender. <ol><li> Preparación de la solución de quinina <ul><li> Disolver el clorhidrato de quinina en agua destilada para hacer una solución madre 0,1 M (1.98g en 50 ml de agua destilada). La solución madre se mantuvo a -20 ° C durante un máximo de un año en pequeñas alícuotas </li><li> Prepare una solución de trabajo de 1 M por dilución de la solución madre en agua destilada. </li></ul></li><li> Preparación de la T-Maze <ul><li> T-laberinto formado por la columna central con la puerta de la trampa y dos cámaras independientes, una cámara de &quot;oscuro&quot; y un &quot;iluminado&quot; de la cámara (Figura 1). </li><li> Preparación de la cámara: tomar dos tubos de 15 ml de centrífuga de plástico y corte en la marca de 2 ml de la parte inferior cerrada final con una sierra manual. Ajustar los adaptadores en cada extremo, y sellar la conexión con parafilm. El adaptador en el extremo del tubo sirve como la ranura de entrada para la fuente de luz de cuello de cisne. Conecte un tubo con la fuente de luz y de este tubo será el &quot;iluminado&quot; de la cámara. Envuelva el otro tubo con papel de aluminio para servir como el &quot;oscuro&quot; de la cámara. </li><li> Añadir 180uL ya sea de agua destilada o una solución de quinina para filtro de papel y lugar en la cámara de luz. </li><li> Monte el laberinto en T atornillando las cámaras iluminadas y oscuras a cada lado de la columna central, con la puerta de la trampa en el medio cerrado (Figura 1). </li><li> Inserte la fuente de luz en la cámara encendida. </li></ul></li><li> Formación vuela a suprimir fototaxis con estímulos aversivos <ul><li> Desenrosque la cámara oscura de la T-laberinto y la transferencia de una sola mosca en esta cámara y de inmediato el tornillo del tubo oscuro de nuevo al laberinto. </li><li> Apague las luces en la habitación y enciende la luz roja. </li><li> Permitir la marcha de aclimatación en la cámara oscura durante 30 segundos y poco a poco de encender la fuente de luz que ilumina la cámara encendida. Abra lentamente la puerta de la trampa que separa las dos cámaras. </li><li> Si la mosca camina hacia la cámara encendida durante 10 segundos, se considera positiva fototácticas y está listo para ser entrenados para el ensayo. El fracaso en fototaxis indica problemas en el sistema visual y las moscas con fototaxis negativas deben ser excluidos de la prueba. </li><li> Para aversivo supresión Phototaxis (APS) formación, toque la marcha que demostró fototaxis positivo de nuevo a la cámara oscura, cerca de la puerta de la trampa y apagar la luz. Espere 30 segundos de aclimatación. Durante este tiempo, poner un papel de filtro con una solución de quinina en la cámara encendida. Abra lentamente la puerta de la trampa y encender la luz. Deje que el caminar volar a la quinina recubierto cámara encendida. Después de un minuto, toque en el vuelo de regreso a la cámara oscura y repita este 9 veces más. (Por lo general, de tipo salvaje moscas evitar la cámara iluminada de 3 a 5 ensayos de entrenamiento.) </li><li> Inmediatamente después del entrenamiento, cinco ensayos de prueba se llevará a cabo. En cada ensayo, test, esperar 10 segundos después de que la luz se enciende durante la marcha entrenados para caminar con la cámara encendida. La falta de pie de la iluminación vial será registrado como &quot;Aprobado&quot;, lo que equivale a &quot;tarea aprendida a través del refuerzo&quot;. La tasa de aprobación de más de cinco ensayos consecutivos, se registra y se muestra en la Figura 2 como PC0 (0 acondicionamiento post hr). </li></ul></li><li> Evaluar a corto plazo de la función de memoria en las moscas <ul><li> Después de la formación inicial y grabaciones PC0, cada mosca se coloca de nuevo en su frasco de alimento original y se mantuvo a un lado durante seis horas. </li><li> Seis horas después del entrenamiento, cada sujeto volar a cinco ensayos de nuevo en la misma forma que antes, y registrar el número de veces que la mosca evita (pasa) o entra en (no) el vial iluminada. Esta tasa de aprobación se registra como PC6 (6 acondicionamiento post hrs), el cual es un indicador de la memoria a corto plazo. </li></ul></li></ol> 6. Interpretación de datos y análisis estadístico <ol><li> Ensayo geotaxis negativo <ul><li> La información bruta obtenida a partir de este ensayo representa el número de moscas cruzar la marca de 8 cm en 10 segundos en cada grupo. Convertir esto en porcentaje y se calcula la tasa de aprobación promedio para cada grupo de más de 10 sesiones. </li><li> Los datos se representan gráficamente como una tasa de aprobación promedio por grupo (genotipo, tratamiento, etc) con el error estándar de la media (SEM). </li><li> Diferencias entre los gruposentonces se puede determinar que son estadísticamente significativas o no con un t de Student o ANOVA. </li></ul></li><li> Aversivo Phototaxis ensayo de supresión <ul><li> Los datos en bruto de este ensayo es representada como el número de veces que cada mosca evita la cámara encendida en cinco ensayos sucesivos. La tasa de aprobación se calcula como el porcentaje de ensayos para evitar el éxito en los ensayos total. Calcular la tasa de aprobación promedio de esta manera durante un mínimo de 15 moscas por grupo. </li><li> Los datos se representa gráficamente como tasa de aprobación promedio PC0 (inmediatamente después del acondicionamiento, el &quot;aprendizaje&quot; indicador) o tasa de aprobación promedio de PC6 (6 horas después del acondicionamiento, la &quot;memoria&quot; indicador) con sus respectivos SEM. </li><li> Los índices de aprendizaje y la memoria se comparó entre los grupos con tanto de tipo salvaje y &quot;genéticamente manipulados-benigno&quot; del grupo (por ejemplo, la sobreexpresión de GFP moscas) de manera apropiada. </li></ul></li></ol> 7. Resultados representante En este experimento de vídeo, estamos evaluando los déficits de aprendizaje y la memoria y el motor en las moscas que sobreexpresan humanos Tau en el sistema nervioso central y comparar sus resultados con los de las moscas que sobreexpresan GFP. Sobreexpresión del Tau neuronal humano en Drosophila se ha demostrado que causa vacuolización severa en el cerebro 8 y conducir a importantes déficits en el aprendizaje y las funciones de memoria 9. Como se muestra en la Figura 2A, 10 días de sexo masculino o femenino moscas que sobreexpresan humanos Tau tienen importantes déficits locomotores en comparación con la misma edad que sobreexpresan GFP moscas. Además, estas moscas no asociar la luz con un sabor amargo, como se muestra por tasa de aprobación PC0 en comparación con el grupo de control, así como dejar de recordar esta asociación, como se muestra por una disminución en la tasa de aprobación PC6 (Figura 2B). Este experimento sirve para validar que los modelos de Drosophila puede ser utilizado para el estudio de enfermedades neurodegenerativas humanas y la recapitulación de algunos de los fenotipos de comportamiento observados en los seres humanos y mamíferos. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. T-laberinto de instalación de ensayo de supresión Phototaxis aversivo. A. La configuración general experimental para el experimento de APSA con la fuente de luz conectado a la &quot;iluminada&quot; tubo Falcon, forrado con papel de filtro y el tubo de &quot;oscuro&quot; de la izquierda (cubierto en papel de aluminio), separadas por una puerta trampa. B. Durante la fase de formación y las pruebas, la mosca en la cámara oscura y la puerta trampa se abrió después de que la luz se enciende en la cámara encendida. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Los resultados representativos de la geotaxis negativos y experimentar APS con moscas que sobreexpresan GFP o Tau con un controlador de pan-neuronal. A. En el ensayo de geotaxis negativos, 10 días de edad de sexo masculino (columna azul) o mujer (columna roja) las moscas que sobreexpresan GFP mostró una mayor actividad de la escalada de Tau con sobreexpresión de las moscas. B. 20 días de edad, las moscas hembra que sobreexpresan GFP mostró un mejor aprendizaje (PC0) y la memoria (PC6) las funciones de Tau sobreexpresión moscas.

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Ambos geotaxis negativos y los ensayos de APS son sólidas pruebas de comportamiento para medir los cambios en el aparato locomotor o el aprendizaje y la capacidad de memoria que surgen de la manipulación genética o el medio ambiente. Sin embargo, hay algunas desventajas para estos ensayos que esperan una mayor optimización. En el ensayo de geotaxis negativo, las mutaciones en ciertos genes pueden hacer que las disfunciones graves de motor en las moscas. En tales casos, las moscas no pueden subir las paredes, en respuesta a la gravedad en la agitación. Otros ensayos que miden directamente el comportamiento de movimiento puede ser más apropiado. Estos ensayos incluyen el comportamiento de los reflejos que las medidas de la parálisis y convulsiones 10, y el comportamiento optomotor 11 que registra la pérdida de la coordinación del movimiento. En el ensayo de APS, el primer obstáculo puede ser moscas al azar con parada en la entrada de la cámara encendida sin avanzar. Esto se convierte en un problema si el envejecimiento es una de las condiciones estudiadas, ya que las moscas mayores son menos activos en general, y tienden a detenerse y descansar durante largos períodos de tiempo. En este caso, el investigador tiene que proporcionar los estímulos mecánicos para promover el movimiento, que no siempre es eficaz. En segundo lugar, se podría argumentar que el hecho de ir a los resultados de la cámara iluminada de una pérdida de fototaxis positivo. Esto es raramente el caso, ya que el trabajo previo ha demostrado que las moscas de volver a la sensibilidad de la luz una vez que el negativo se elimina reforzar 4. En tercer lugar, la duración del contacto con el estímulo aversivo puede variar de un ensayo a otro. Esta variación normalmente se puede reducir rodea la pared interior de la cámara con papel de filtro empapado de evitar que las moscas evitando la quinina. Además, el experimentador puede asegurar que cada vuelo pasan suficiente tiempo en contacto con el papel de filtro por el aumento de la cantidad de tiempo empleado en la cámara de lo contrario 1 minuto. En resumen, geotaxis negativos y los ensayos de APS son una forma rápida y sencilla de evaluar los déficit de comportamiento y cuantitativamente indican locomotor y capacidades de aprendizaje y memoria en Drosophila. Estos ensayos son particularmente útiles en la modelización de enfermedades neurodegenerativas humanas en Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiales </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentario </th></tr><tr><td> Poliestireno Vial </td><td> Vial del Capitolio, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 mm de poliestireno Vial; calidad de los materiales importantes, lo malo, si es demasiado resbaladizo para las moscas de subir. </td></tr><tr><td> Disección Estereoscopio </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 ramas de cuello de ganso de guía de luz (12V/30W) </td></tr><tr><td> Clorhidrato de quinina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Disolver en agua destilada. </td></tr><tr><td> Conectores de desconexión rápida </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polietileno de Alta Densidad </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Simples sistemas de comportamiento </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De un solo canal 200 pipeta l </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

Los avances en los métodos genéticos han permitido el estudio de genes implicados en enfermedades neurodegenerativas humanas utilizando Drosophila como sistema modelo 1. La mayoría de estas enfermedades, incluyendo el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington se caracteriza por depender de la edad deterioro en las funciones de aprendizaje y la memoria y la coordinación del movimiento 2. Aquí usamos los ensayos de comportamiento, incluyendo el ensayo geotaxis negativo 3 y el ensayo de supresión phototaxic aversivo (APS ensayo) 4,5, para demostrar que algunas de las características de comportamiento asociados a la neurodegeneración humano puede ser recapitulado en las moscas. En el ensayo de geotaxis negativo, la tendencia natural de las moscas para moverse contra la gravedad cuando se agita se utiliza para estudiar los genes o las condiciones que pueden dificultar la capacidad del aparato locomotor. En el ensayo de APS, las funciones de aprendizaje y la memoria se prueban en forma positiva-fototácticas moscas entrenados para asociar la luz con el sabor desagradable amargo y así evitar esta tendencia por lo demás natural a moverse hacia la luz. Prueba de estas moscas entrenados 6 horas después de la capacitación se utiliza para evaluar las funciones de memoria. El uso de estos ensayos, la contribución de factores genéticos o ambientales hacia el desarrollo de la neurodegeneración puede ser fácilmente estudiado en moscas.

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria en<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.2K vistas.  University of Miami, Miller School of Medicine. Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria en Drosophila.

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Investigación

Neurociencias

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#39;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memoryand long-term spatial memory 1. The MWM is a relatively simple procedure typically consisting of six day trials, the main advantage being the differentiation between the spatial (hidden-platform) and non-spatial (visible platform) conditions 2-4. In addition, the MWM testing environment reduces odor trail interference 5. This has led the task to be used extensively in the study of the neurobiology and neuropharmacology of spatial learning and memory. The MWM plays an important role in the validation of rodent models for neurocognitive disorders such as Alzheimer&#x2019;s Disease 6, 7. In this protocol we discussed the typical procedure of MWM for testing learning and memory and data analysis commonly used in Alzheimer&#x2019;s disease transgenic model mice.

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#039;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze is a behavioral task to test hippocampal-dependent learning and memory. It has been widely used in the study of neurobiology, neuropharmacology and neurocognitive disorders in rodent models.

Agua Morris laberinto de prueba para los déficits de aprendizaje y memoria en ratones de Alzheimer modelo de enfermedad

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto olfativa Choque Aprendizaje

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

La evaluación del aprendizaje espacial y la memoria en pequeños reptiles escamosos

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila condicionamiento del corte como una medida de aprendizaje y memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...