This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li><li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods:+the+optical+disector+and+fractionator.">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li><li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans.">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke;+a.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li><li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain.">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li><li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells.">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).</li><li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung:+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area.">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li><li>Hern&#225;ndez-Jim&#233;nez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage.">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Y&#233;benes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+overload,+measured+as+serum+ferritin,+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion.">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li><li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent,+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke.">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPAR&#947;+Agonist+Rosiglitazone.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPAR&#947; Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

El modelo de isquemia cerebral introducido aquí da los volúmenes de infarto altamente reproducibles determinaron 24-48 horas y 7 días después de la ligadura de MCA por diferentes enfoques 8,15,17. Este modelo MCAO tiene una tasa de mortalidad baja (menos del 1%) en comparación con otros, minimizando el número de animales utilizados en los estudios. Un paso crítico para obtener esta baja tasa de mortalidad es de asepsia adecuadas para evitar las infecciones que pudieran afectar la supervivencia después del accidente cerebrovascular inducción. Este modelo MCAO no sólo se puede utilizar como un modelo MCAO permanente, que se considera un modelo relevante para la investigación clínica de traslación 18, sino también como un modelo transitorio por la ligadura transitoria de la CCA y MCA con un nudo corredizo y la reperfusión posterior en el tiempo deseado 19. Este método ha sido utilizado con éxito en ratones y ratas 17,20. Todo esto evidencia indica que MCAO por la ligadura es un modelo versátil alta de la isquemia cerebral con múltiples aplicaciones. Un critiCal paso de esta técnica es que requiere cirugía invasiva bajo un microscopio estereoscópico; la craneotomía debe realizarse con mucho cuidado para no dañar el hueso cigomático, así como la MCA. Sin embargo, (no se realiza que están sometidos a la técnica quirúrgica sino CCA y MCA ligadura) el uso de animales de simulación proporciona una herramienta útil para discriminar los efectos del procedimiento dependiente quirúrgicos. La extensión de la lesión cerebral después de esta técnica puede ser cuantificada por varios métodos. Nuestro protocolo de seccionamiento cerebro, la tinción de Nissl y posterior estimación del volumen por Cavalieri permite una cuantificación exacta de la región dañada y minimiza el número de ratones utilizados en este tipo de estudios, ya que las secciones del cerebro de serie también se pueden utilizar para diferentes análisis inmunohistoquímico. Para un mejor rendimiento de esta metodología, es fundamental para elegir los parámetros adecuados utilizados en el software estereología (Tabla 1), que será necesario para la estimación ªe volumen de las diferentes regiones por la fórmula: V = 1 / SSF * a * f * t ΣP i (SSF es la fracción de muestreo rebanada, t es el espesor medio de las secciones, una f es el área de la separación de la red y ΣP el número de puntos que golpean la estructura). El MCAO distal por la ligadura puede ser útil para caracterizar los leucocitos infiltrados y subpoblaciones de células inmunes 8,13 que participan en el proceso inflamatorio después de una lesión cerebral 1-4. Aquí, se proponen dos metodologías diferentes para la caracterización de las células inmunes del cerebro, un enfoque estereológico precisa y un análisis de citometría de flujo para una mejor caracterización de varias subpoblaciones de leucocitos. Tomando ventaja de seccionamiento cerebro de serie, la cuantificación del número total de neutrófilos se puede lograr por el método del fraccionador óptico 16, que estima el número total de células a partir del número de células en la muestra del ingenioha muestreo aleatorio (SRS) conjunto sistemático de espacios virtuales imparciales de conteo que cubren toda la región de interés, en nuestro caso la región del infarto, con una distancia uniforme entre los espacios virtuales de conteo imparciales en las direcciones X, Y y Z. Este método proporciona una herramienta precisa para estimar el número total de neutrófilos en el cerebro isquémico en diferentes momentos después de la ligadura. Aunque no se ha demostrado en este estudio, este protocolo también se puede utilizar para la estimación de las diferentes subpoblaciones de neutrófilos después de la isquemia y 21 para una cuantificación exacta de cualquier otra población de células que se encuentra en el cerebro isquémico como otros leucocitos infiltrados (monocitos / macrófagos) así como la estimación neuronas supervivientes o incluso para la cuantificación neurogénesis después del accidente cerebrovascular. El paso más importante para una estimación precisa en el área deseada es la selección de los parámetros adecuados, como los que se muestran en la Tabla 3 para la cuantificación de los neutrófilos en la zona isquémica.Estos parámetros se utilizan para que el software estereología para calcular el número total de células positivas (N) mediante el uso de la ecuación N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- es el número total de células contadas con fraccionador, ssf es la fracción de muestreo sección, asf es el área fracción de muestreo, y TSF es el espesor fracción de muestreo) 5. Aunque esta metodología es más lenta que otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, el análisis de marcadores de los neutrófilos por mg de tejido, densitometría de imágenes o el número de neutrófilos por campo de representación), tiene la ventaja de ser un imparcial y una técnica sólida que proporciona una precisa la cuantificación del número de células. El enfoque de aislamiento de leucocitos cerebro permite una identificación y cuantificación simultánea de varios subtipos de células inmunes sin la necesidad de sesgo del sistema por tinción in vivo o manipulaciones genéticas. Tras la clasificación celular de la p mieloide caracterizadoopulations o su separación inmunomagnética se pueden utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, tales como nuevos estudios sobre expresión de genes o proteínas. La caracterización precisa de neutrófilos, monocitos y microglía obtenido con este método proporciona una alta especificidad con respecto a los métodos existentes, tales como los estudios de inmunohistoquímica, una ventaja que permite la asignación de funciones específicas a las diferentes células mieloides que median cerebro respuesta inmune innata. Además, se puede ampliar aún más para caracterizar otras poblaciones cerebrales con la etiqueta apropiada, como sangre nacido macrófagos (CD11b + CD45 hi CD68 +), y se puede aplicar para el estudio de otras patologías del SNC o lesiones. Por lo tanto, esta técnica proporciona una herramienta esencial para explorar la heterogeneidad de la respuesta inflamatoria en el cerebro. Una limitación principal de esta técnica reside en la preparación de las suspensiones de leucocitos a partir de tejido cerebral fresco, que puede alterar laestado de activación de las células o su alteración antígeno. Aunque esta técnica permite una caracterización cualitativa más detallada en comparación con los estudios inmunohistoquímicos, que proporciona una cuantificación precisa menos basado en el aislamiento de células. A pesar de esto, la eficacia de nuestro protocolo de aislamiento de células es similar a otras metodologías publicadas 9 y puede ser utilizado de manera eficiente para detectar diferencias en el número de células inmunes del cerebro entre el control y los grupos de MCAO o incluso entre los grupos MCAO sometidas a diferentes tratamientos 8. Los pasos críticos de este protocolo son la disección del tejido, el procedimiento de interrupción del tejido, y la retirada de mielina. En cuanto a la recogida de tejidos, una etapa de normalización puede ser incluido (pesando el tejido recogido) para evitar la variabilidad debido a las diferentes actuaciones de disección. Además, la normalización entre los diferentes grupos MCAO también puede ocurrir a través de el volumen de infarto (determinado previamente por Magnetic Resonance). Otra manera de resolver este problema es utilizar todo el hemisferio ipsilateral de ambos grupos isquémicos y de control, o incluso usar el hemisferio contralateral del ratón isquémico como un control para minimizar el número de animales utilizados. Si bien este enfoque evita diferencias entre cada disección, tiene una desventaja principal; un factor de dilución se añade mediante el aumento del número total de células, pero no el número de células mieloides que se encuentran exclusivamente en las áreas centrales y peri-infarto de la corteza ipsilateral. En cuanto a la interrupción del tejido, este protocolo ilustra los pasos para la ruptura mecánica de las células del cerebro, evitando tratamientos enzimáticos y prevenir antígeno de superficie alteración 9,22, una cuestión esencial para su posterior análisis cualitativo y cuantitativo de las subpoblaciones de células inflamatorias. Además de la preparación de la suspensión celular de interés, la eliminación de mielina de muestras de cerebro es un paso muy recomendable para evitar interferencias con downstresma aplicaciones, tales como la separación de células inmunomagnética o citometría de flujo 23,24. Esto se puede lograr usando diferentes métodos, como sacarosa o gradientes de Percoll, o perlas anti-mielina. Aquí, y en base a estudios previos que comparan diferentes métodos para el aislamiento de suspensión de células del cerebro, rotura mecánica en combinación con el uso de Percoll para eliminar la mielina se utiliza para mejorar el rendimiento y la viabilidad celular 25.

Morfológicas, fenotípicas y alteraciones de la expresión génica de microglia, así como la extravasación y la activación de los macrófagos y neutrófilos hematógenas se cree que desempeñan un papel fundamental en la cascada fisiopatológica después de una lesión cerebral 1-4. Este protocolo proporciona dos métodos para estimar el número de diferentes subconjuntos de células mieloides del cerebro isquémico y para llevar a cabo su caracterización fenotípica. Además, también proporciona una descripción de un modelo experimental de isquemia cerebral en ratones, que consiste en la ligadura transitoria o permanente de la arteria cerebral media tanto distal (MCA) y la arteria carótida común (CCA), incluyendo la forma de evaluar el infarto por el método de Cavalieri precisa el uso de un software estereológico. El primer enfoque para caracterizar subconjuntos de células mieloides del cerebro isquémico es un método estereológico basado en el enfoque fraccionador óptico 5. Este es el máscomúnmente utilizado sonda estereológico en ciencias de la vida y proporciona un alto grado de precisión con bajos coeficientes de error 5-7. Esta es la mejor opción para la cuantificación de células cuando el tejido se corta en secciones, ya que evita el sesgo en la estimación de la célula debido a la fragmentación del tejido en secciones. Este método es una forma muy poderosa para caracterizar los números, la dinámica y los cambios fenotípicos de las subpoblaciones de neutrófilos infiltrados del tejido isquémico 8. El segundo enfoque se basa en la caracterización de un protocolo modificado de Campanella y colaboradores 9 que proporciona una manera simple para aislar suspensiones de leucocitos cerebrales y caracterizarlos por citometría de flujo. En contraste con las técnicas de inmunohistoquímica convencionales, citometría de flujo caracterización permite diferenciar entre microglia (CD45 lo CD11b +) y se infiltró células mieloides (CD45 hi CD11b +) en función de su difflos niveles de expresión de CD45 erent 9-13. Además, los monocitos proinflamatorios (CD45 hi CD11b + Ly-6G - hi Ly-6C), neutrófilos (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) y otros leucocitos subconjuntos del tejido isquémico se pueden distinguir. Este enfoque proporciona un ensayo rápido y fiable para evaluar la neuroinflamación en modelos experimentales de isquemia cerebral. Sin embargo, el procesamiento de tejido puede influir en el estado de activación y los números de las diferentes poblaciones de células que se encuentran en el tejido isquémico proporcionar una caracterización semi-cuantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Activación de la microglía, así como la extravasación de los macrófagos y neutrófilos hematógena, se cree que desempeñan un papel fundamental en la lesión cerebral después del accidente cerebrovascular. Estas subpoblaciones de células mieloides pueden mostrar diferentes fenotipos y funciones y la necesidad de ser distinguido y caracterizado para estudiar su regulación y su contribución al daño tisular. Este protocolo proporciona dos metodologías diferentes para la caracterización de las células inmunes del cerebro: un enfoque estereológico precisa y un análisis de citometría de flujo. El enfoque estereológicos se basa en el método fraccionador óptico, que calcula el número total de células en un área de interés (cerebro infartado) estimado por un muestreo aleatorio sistemático. El segundo enfoque caracterización proporciona una manera simple para aislar suspensiones de leucocitos cerebro y caracterizar ellos por citometría de flujo, lo que permite la caracterización de microglia, infiltrado de monocitos y neutrófilos del tejido isquémico. Además, también D.etails un modelo de isquemia cerebral en ratones que afecta exclusivamente corteza cerebral, generando infartos altamente reproducibles con una baja tasa de mortalidad, y el procedimiento para el procesamiento histológico del cerebro para caracterizar el volumen de infarto por el método de Cavalieri.

El modelo de isquemia cerebral que se muestra aquí genera infartos visto exclusivamente en la corteza, sin afectar el tejido estriatal desde las ramas lenticulostriatal de la MCA que irrigan el cuerpo estriado no se ocluyen (Figura 1). Por tinción de Nissl, el área dañada puede ser identificado como un área cortical hipocrómica (Figura 2). Este modelo se caracteriza por volúmenes de infarto altamente reproducibles a las 24 horas después de MCAO (% IH 15,89 ± 0,28) estimado por el método de Cavalieri en secciones teñidas con Nissl (Figura 2). Estimación del volumen infartado por el método de Cavalieri es un enfoque preciso con un bajo error que se refleja en el coeficiente de error (CE) de Gundersen en los hemisferios contralesional y ipsilesional así como en el área infartada (Tabla 2). Volumen de tejido dañado puede ser expresada en mm 3, sino también como% IH usando la fórmula en la sección 3.2.13. Además, la estimacióndel volumen total de las regiones ipsilesional y contralesional permite el cálculo del índice de edema de corregir el volumen infartado y para evitar una sobreestimación del tejido dañado (Tabla 2). Dado el procesamiento de seccionamiento de serie del tejido cerebral, esto puede ser aprovechado para llevar a cabo una estimación exacta del número total de las subpoblaciones de células, como los neutrófilos infiltrados, en el área isquémica, utilizando el enfoque fraccionador óptico (Figura 3 y Tabla 4) con los parámetros que se muestran en la Tabla 3. Este protocolo se estima un total de neutrófilos (células Ly6G-positivos) en el área infartada de 23.328 ± 3.623 a las 24 horas y 82 856 ± 8143 a las 48 h en ratones después pMCAO (Figura 3D). De acuerdo con estudios anteriores, la infiltración de neutrófilos se correlaciona directamente con el tamaño del infarto (Figura 3E). Estimación de tél número de neutrófilos por el método fraccionador óptico es un enfoque preciso con un bajo error que se refleja por la CE de Gundersen (Tabla 4). El aislamiento de leucocitos y citometría de flujo protocolo de caracterización permite el aislamiento de 47.922 ± 23.174 células mieloides a partir de la corteza del hemisferio ipsilesional de los ratones isquémicos. Esto comprende el 10-30% de los eventos totales se encuentran en la suspensión celular. La gran mayoría de los eventos capturados utilizando este protocolo presente un parámetro bajo FSC, asociado a restos celulares (Figura 4). Tinción CD11b muestra que las células CD11b + tienen un valor FSC más alto (Figura 4), ​​lo que sugiere que los restos celulares no está etiquetado con este marcador y, como se ha indicado anteriormente, que se puede excluir del análisis adicional ajustando el umbral FSC en 200 9. La cantidad variable de los residuos celulares obtenidos con este método sugiere que las diferencias en el proceso de la muestraING (tiempo, la conservación del tejido, temperatura de la muestra, la eliminación de mielina eficiente, etc.) puede dar cuenta de ello. Además, también se necesita el uso de filtros celulares para evitar la presencia de abrazaderas celulares en las muestras; este paso se debe hacer antes de la tinción celular. Usando la estrategia gating se muestra en la Figura 5 que se basa en CD11b y CD45 expresión, podemos discriminar entre residente y células mieloides infiltrado en el tejido isquémico. Este CD11b + aumento de la población en el hemisferio isquémico en comparación con la ingenua y con el grupo de simulación, en el que estas células se asocian principalmente a una baja expresión de CD45 indica que la microglia está proliferando después de la isquemia (Figura 4, Figura 5 y Tabla 5) . Esta diferencia es probablemente debido a la infiltración de células de la periferia, como se evidencia por la aparición de una subpoblación de células CD11b + hi CD45 en el cerebro isquémico (Figura 4, La Figura 5 y la Tabla 5), que es de bajo número en ingenuo y en el cerebro simulado. La contribución de los infiltrados a la población de células CD11b + en la isquemia cerebral es un proceso muy dinámico 4. En el modelo MCAO por ligadura, que puede variar de 30% a 60% del total de células CD11b +, dependiendo del tamaño de la lesión y del tiempo cuando la caracterización se ha hecho. Los neutrófilos, caracterizadas como células Ly-6G +, son los más numerosos de la población de células infiltradas encontrado a las 24 horas después de MCAO en el cerebro isquémico ratón usando este modelo de isquemia cerebral, ya que constituyen el 70-80% de la CD11b + CD45 hi. El resto de las células son en su mayoría una subpoblación de CD11b + CD45 hi Ly-6G - Ly-6C hi monocitos proinflamatorios. En este modelo, esta población se incrementará en número en las áreas cerebrales isquémicos de 24 a 48 horas después de MCAO. Figura 1:. Procedimiento quirúrgico para la ligadura de MCA (A) después de la retracción del músculo temporal, un pequeño craneotomía se lleva a cabo en el cráneo del ratón. MCA es ligado por un nudo o un nudo corredizo con sutura 9/0. (B) Imágenes representativas de la lesión cortical generada por el modelo MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Figura 2: Cuantificación de volumen de infarto por Cavalieri. (A) Imágenes representativas de secciones del cerebro teñidas con Nissl 24 horas después de la ligadura permanente MCA. El gran aumento muestra el área hipocromatic después de la tinción de Nissl queidentifica el área dañada (núcleo) después de MCAO. También se muestra la (PI) región peri-infarto. (B) Cuantificación del volumen del infarto representado como% hemisferio infartado (IH%) utilizando el método de Cavalieri en secciones teñidas con Nissl de serie, 24 horas después de MCAO (n = 50 ratones ). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Figura 3: la cuantificación Estereológico de neutrófilos en el área infartada 24 y 48 hr después de la ligadura, utilizando el método fraccionador óptico. (A) Imagen Representante de neutrófilos (células infiltradas Ly6G-positivos) en el área isquémica en 24 horas después de MCAO. Delimitación muestra el área infartada. (B, C) ​​Ejemplos de un disector óptico para la cuantificación de neutrófilos por el fraccionador óptico. (D) Cuantificación de los neutrófilos totales en la región infartada a las 24 y 48 h (n = 4 ratones). (E)La correlación del número de neutrófilos con el tamaño del infarto a las 24 y 48 horas después de la ligadura de MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Figura 4:. Representante análisis de dispersión punto de parcelas de leucocitos cerebrales obtenido de hemisferios ingenuo, farsa y isquémica (24 horas después de MCAO) sobre la base de parámetros físicos (SSC y FSC) Se identificó una población de eventos que expresan CD11b (rojo) en todos los grupos. Esta población fue cerrada y caracteriza de acuerdo a la expresión de CD45. Las células que expresan bajos niveles de CD45 (verde) estaban presentes en la corteza cerebral isquémica y no isquémica y correspondían a las células microgliales. En contraste, las células que expresan altos niveles de CD45 (amarillo) eran sóloque se encuentra en el hemisferio isquémico y en menor medida en grupo simulado. Un análisis más detallado de la población de alta CD11b + CD45 indica que los neutrófilos (Ly-6G + células, azul) y pro-inflamatorias monocitos (células hi Ly-6C, naranja) son los principales subpoblaciones de células que se encuentran en el cerebro se infiltra en las 24 horas después del accidente cerebrovascular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Figura 5:. Gating estrategias para diferenciar residente a partir de células mieloides infiltrado en el tejido isquémico celular CD11b + fueron cerrada primero de acuerdo con la intensidad de fluorescencia de isotipo (A). Un gráfico de puntos representativos de las suspensiones de células del cerebro isquémico se muestra en la esquina superior derecha del panel. EnAdemás, los valores típicos para el número total de eventos y para el número de CD11b + eventos adquiridos usando esta técnica se muestra (no de células / hemisferio cerebral isquémico;. (A) análisis de intensidad de fluorescencia CD45 de las células CD11b + se muestra en el panel B. Un análisis representativo gráfico de puntos de CD45 y CD11b expresión de la cerrada subpoblación CD11b + se muestra en la esquina superior derecha del panel. Además, el número típico de células CD45 hi lo CD45 adquiridos por el hemisferio cerebral isquémico utilizando esta técnica se muestra (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Los parámetros utilizados para el método de Cavalieri </td></tr><tr><td> Sección Espesor (t) </td><td> 30 micras </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Fracción de muestreo de la rebanada (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Distancia entre secciones </td><td> 600 micras </td></tr><tr><td> Espaciado de cuadrícula </td><td> 100 micras </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Parámetros utilizados para la cuantificación estereológicos del tejido infartado. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Resultados </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarto </td></tr><tr><td> Superficie (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> Volumen (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Volumen corregido por A lo largo de la proyección (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coeficiente de error (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coeficiente de error (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coeficiente de error (Gundersen), alfa (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Hemisferio Infartado </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Cerebral Edema (Ips Vol / Vol Cont) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Ejemplos representativos de volúmenes contralesional, ipsilesional y de infarto por el método de Cavalieri utilizar el Software Investigador estéreo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colpalmo = &quot;2&quot;&gt; Parámetros utilizados para el fraccionador óptico </td></tr><tr><td> Sección Espesor (TSF) </td><td> 30 micras </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fracción de muestreo de la rebanada (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Contando Cuadro Altura </td><td> 40 micras </td></tr><tr><td> Contando Ancho de marco </td><td> 40 micras </td></tr><tr><td> Tamaño de la cuadrícula X </td><td> 230 micras </td></tr><tr><td> Tamaño de la cuadrícula X </td><td> 230 micras </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 micras </td></tr><tr><td> Óptico Disector Altura </td><td> 14 micras </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Parámetros utilizados para la cuantificación estereológico de neutrófilos infiltrados tras la isquemia cerebral con la sonda fraccionador óptico utilizando el Software Investigador estéreo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Estimación de neutrófilos por el fraccionador óptico </td></tr><tr><td> Número de sitios de muestreo </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Forma Factor </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Marcadores totales Contado </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Los neutrófilos Estimados fraccionador óptico </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coeficiente de error (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Coeficiente de error (Gundersen), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Ejemplo representativo de los neutrófilos infiltrados estimados después de la isquemia cerebral con la sonda fraccionador óptico utilizando el Software Investigador estéreo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Los neutrófilos </td><td> Los monocitos </td><td> La microglía </td></tr><tr><td> Ingenuo </td><td> 25863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19012 ± 1523 </td></tr><tr><td> Sham 24 horas </td><td> 24563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1.124 ± 391,5 </td><td> 23734 ± 2910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 horas </td><td> 47922 ± 23174 </td><td> 4.874 ± 748,7 </td><td> 4,826 ± 1,345 </td><td> 35395 ± 10833 </td></tr></tbody></table> Tabla 5: Los resultados representativos de las células mieloides estimados después de la isquemia cerebral con la citometría de flujo enfoque.

Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Cerebro células mieloides caracterización después del accidente cerebrovascular se puede realizar por estereología utilizando el método del fraccionador óptico, o por un análisis de citometría de flujo de cerebro leucocitos suspensiones. Ambas son técnicas útiles para realizar una distinción fenotípica precisa de los principales subconjuntos de células mieloides que se encuentran en el cerebro isquémico.

Estereológico y Citometría de Flujo Caracterización de leucocitos subpoblaciones en Modelos de transitorios o isquemia cerebral permanente

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K vistas.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  Cerebro células mieloides caracterización después del accidente cerebrovascular se puede realizar por estereología utilizando el método del fraccionador óptico, o por un análisis de citometría de flujo de cerebro leucocitos suspensiones. Ambas son técnicas útiles para realizar una distinción fenotípica precisa de los principales subconjuntos de células mieloides que se encuentran en el cerebro isquémico. 

Video: Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Investigación

Medicina

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

En tiempo real de imágenes digitales de los leucocitos del endotelio interacción en el daño por isquemia-reperfusión (IRI) del músculo cremáster Rata

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Permanente oclusión vascular cerebral<em&gt; Vía</em&gt; Ligadura doble y transección

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realización Permanente distal cerebral media carótida común con oclusión de la arteria en ratas de edad avanzada para el Estudio de la isquemia cortical con sostenida de la discapacidad

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.