O protocolo fornece um modelo para investigar mecanismos de lesão vascular e subsequente desenvolvimento de edema de forma não invasiva. A principal vantagem desta técnica é que você pode acompanhar a lesão ao vivo ao longo do tempo sem intervenção cirúrgica. Isso fornece caminhos para testar tratamentos de forma mais eficiente.
Pode ser um desafio aprender a realizar o veio adequado da cauda e acomodar o animal na plataforma corretamente. Para ambas as técnicas, recomendo ser paciente e levar as coisas devagar. Para começar, manuseie suavemente o cabo de fibra óptica e conecte-o à caixa de controle do laser e ao adaptador a laser do microscópio de imagem da retina e, em seguida, ligue a caixa da lâmpada do microscópio de imagem da retina.
Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens. Coloque um pedaço de papel branco na frente da ocular do microscópio e ajuste o balanço de branco clicando em Ajustar no programa de imagem. Ligue a caixa de controle a laser girando a tecla e seguindo as instruções na tela da caixa de controle a laser.
Para verificar a potência do laser de linha de base, defina a caixa de controle do laser para 50 miliwatts e 2.000 milissegundos. Em seguida, ligue o laser e coloque o medidor de energia na frente da ocular. Pressione o pedal do pedal do pedal para ativar o laser, visando que a leitura de energia do laser seja de 13 a 15 miliwatts.
Em seguida, usando a tela da caixa de controle do laser, ajuste a potência experimental do laser para 100 miliwatts e 1.000 milissegundos e desligue o laser. Despeje 300 mililitros de água em um copo de 500 mililitros e aqueça o copo em um forno de micro-ondas por um minuto. Em seguida, coloque uma gaze na água morna.
Em seguida, coloque um rato macho de dois meses de idade em uma contenção. Pressione a gaze quente na cauda do rato suavemente e procure as veias dilatadas. Usando uma agulha de calibre 26, injete a quantidade apropriada de rosa bengala de acordo com o peso do animal e aplique pressão no local da injeção para evitar hematoma ou sangramento antes de limpar o local.
Em seguida, solte o mouse da contenção e devolva-o à gaiola. Aguarde oito minutos para que a rosa bengala circule antes da injeção de anestésicos. Ligue a plataforma do mouse aquecida.
Em seguida, adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida em cada olho do rato. Depois de confirmar a anestesia, adicione uma gota de cloridrato de proparacaína por olho e, em seguida, adicione pomada ocular a ambos os olhos. Em seguida, injete 150 microlitros de carprofeno por via subcutânea entre as orelhas.
Em seguida, acomode o mouse na plataforma e ajuste a plataforma até que a visão do fundo da retina esteja clara e focada. Conte as veias da retina e tire uma imagem do fundo. Em seguida, ligue o laser e aponte para uma veia da retina a aproximadamente 375 micrômetros do disco óptico.
Irradie o vaso pressionando o interruptor do pé e movendo levemente o feixe de laser até 100 micrômetros. Repita este passo três vezes e mova o feixe de laser após cada pulso para que a irradiação não seja focada em um ponto. Repita a irradiação em outros vasos principais para obter duas a três oclusões.
Depois de irradiar os vasos, desligue a lâmpada e aguarde 10 minutos. Em seguida, ligue a lâmpada novamente, conte o número de veias ocluídas e tire uma imagem do fundo. Após a aquisição da imagem e injeção salina, adicione colírios lubrificantes e pomada de gel a ambos os olhos.
Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia e devolva-o à gaiola com outros animais somente quando totalmente recuperado. O número de oclusões obtidas imediatamente após a irradiação a laser não foi diferente entre os animais que foram laserizados 10 e 20 minutos após a administração de rosa bengala. O número de oclusões sustentadas até um dia após a oclusão da veia retiniana diminuiu significativamente em animais laserizados 20 minutos após a administração de rosa bengala, independentemente do genótipo.
Sem modificar a potência experimental de 100 miliwatts, uma baixa potência de laser de linha de base de 11,5 miliwatts resultou em nenhuma oclusão. Em contraste, uma saída de laser basal de 13,5 miliwatts resultou em oclusões bem-sucedidas. Quatro tipos principais de oclusões ocorrem após a fotocoagulação a laser: vasos totalmente ocluídos, vasos parcialmente ocluídos, vasos parcialmente reperfundidos e vasos totalmente reperfundidos.
A vasculatura irradiada de camundongos knockout de células endoteliais Casp9 induzíveis por tamoxifeno passou mais tempo em estados parcialmente reperfundidos e parcialmente ocluídos do que a de camundongos C57 Black 6, que passaram mais tempo em estados totalmente ocluídos. O estado de oclusão dos vasos muda rapidamente nos primeiros 10 minutos após a fotocoagulação a laser e hemorragias em forma de chama são observadas 24 horas após a lesão. Diferentes patologias oftálmicas ocorreram após a oclusão da veia retiniana.
O nível de edema da retina após a oclusão da veia retiniana pode ser quantificado nos olhos lesados usando imagens de tomografia de coerência óptica. O estado das camadas neuronais também pode ser determinado avaliando a desorganização das camadas internas da retina. Um exemplo de uma imagem de tomografia de coerência óptica com os rótulos correspondentes para cada camada é mostrado aqui.
Medir a potência do laser de linha de base é importante. Essa leitura afetará muito o sucesso das oclusões e poderá ser otimizada. Métodos adicionais, como OCT, ERG e Optiger, podem ser realizados.
Isso ajudará a abordar os efeitos da lesão neurovascular na integridade neuronal da retina e na função da via visual. Esta técnica abre o caminho para interrogar as vias moleculares que conduzem a doença neurovascular e, ao seguir animais individuais ao longo do tempo, fornece dados que podem ser mais facilmente traduzidos para doenças humanas.
