이 프로토콜은 비 침습적 방식으로 혈관 손상 및 부종의 후속 발달의 메커니즘을 조사하는 모델을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 외과 적 개입없이 시간이 지남에 따라 부상을 실시간으로 추적 할 수 있다는 것입니다. 이것은 치료를보다 효율적으로 테스트 할 수있는 방법을 제공합니다.
적절한 꼬리 정맥을 수행하고 플랫폼에 동물을 올바르게 수용하는 방법을 배우는 것은 어려울 수 있습니다. 두 기술 모두 인내심을 갖고 천천히 복용하는 것이 좋습니다. 시작하려면 광섬유 케이블을 부드럽게 다루고 레이저 컨트롤 박스와 망막 이미징 현미경의 레이저 어댑터에 연결 한 다음 망막 이미징 현미경 램프 상자를 켭니다.
컴퓨터를 켜고 이미징 프로그램을 엽니다. 현미경 접안렌즈 앞에 백서를 놓고 이미징 프로그램에서 조정을 클릭하여 화이트 밸런스를 조정합니다. 키를 돌리고 레이저 컨트롤 박스 화면의 지시에 따라 레이저 컨트롤 박스를 켭니다.
기준 레이저 출력을 확인하려면 레이저 컨트롤 박스를 50 밀리 와트 및 2, 000 밀리 초로 설정하십시오. 그런 다음 레이저를 켜고 파워 미터를 접안 렌즈 앞에 놓습니다. 풋 스위치 페달을 눌러 레이저를 활성화하고 레이저 출력 판독 값이 13-15 밀리 와트가되도록합니다.
그런 다음 레이저 컨트롤 박스 화면을 사용하여 실험용 레이저 출력을 100 밀리 와트 및 1, 000 밀리 초로 조정하고 레이저를 끕니다. 500 밀리리터 비커에 300 밀리리터의 물을 붓고 전자 레인지에서 1 분 동안 비커를 따뜻하게합니다. 그런 다음 따뜻한 물에 거즈를 넣으십시오.
다음으로 2 개월 된 수컷 마우스를 구속기에 넣습니다. 따뜻한 거즈를 마우스 꼬리에 부드럽게 누르고 확장 된 정맥을 찾으십시오. 26 게이지 바늘을 사용하여 동물의 체중에 따라 적당량의 장미 벵골을 주입하고 주사 부위에 압력을 가하여 혈종이나 출혈을 예방한 후 해당 부위를 닦습니다.
그런 다음 구속기에서 마우스를 풀고 케이지로 되돌립니다. 마취제를 주사하기 전에 장미 벵골이 순환할 때까지 8분 동안 기다립니다. 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
그런 다음 마우스의 각 눈에 페닐에 프린과 트로피 아미드 한 방울을 넣으십시오. 마취를 확인한 후 눈 당 프로 파라카인 염산염 한 방울을 넣은 다음 양쪽 눈에 눈 연고를 바르십시오. 다음으로, 귀 사이에 150 마이크로 리터의 카프로 펜을 피하 주사하십시오.
그런 다음 플랫폼에 마우스를 수용하고 망막 안저의 시야가 명확하고 초점이 맞춰질 때까지 플랫폼을 조정합니다. 망막 정맥을 세고 안저의 이미지를 찍습니다. 그런 다음 레이저를 켜고 시신경 디스크에서 약 375 마이크로 미터 떨어진 망막 정맥을 겨냥하십시오.
풋 스위치를 누르고 레이저 빔을 최대 100 마이크로 미터까지 약간 움직여 용기를 조사하십시오. 이 단계를 세 번 반복하고 각 펄스 후에 레이저 빔을 움직여 조사가 한 지점에 집중되지 않도록합니다. 다른 주요 혈관에 조사를 반복하여 2-3 개의 폐색을 달성하십시오.
용기를 조사한 후 램프를 끄고 10 분 동안 기다리십시오. 그런 다음 램프를 다시 켜고 폐색 된 정맥의 수를 세고 안저의 이미지를 찍습니다. 이미지 획득 및 식염수 주입 후 윤활제 안약과 젤 연고를 양쪽 눈에 추가합니다.
마우스가 마취에서 회복되는 것을 지켜보고 완전히 회복 된 경우에만 다른 동물과 함께 새장으로 되돌립니다. 레이저 조사 직후에 달성 된 폐색의 수는 장미 벵골 투여 후 10 분과 20 분 후에 레이저로 촬영 된 동물간에 차이가 없었다. 망막 정맥 폐색 후 1 일까지 지속되는 폐색의 수는 유전자형과 독립적으로 장미 벵골 투여 후 20 분 동안 레이저로 촬영 된 동물에서 유의하게 감소했습니다.
100 밀리 와트의 실험 전력을 수정하지 않고, 11.5 밀리 와트의 낮은 기준 레이저 출력은 폐색이 발생하지 않았습니다. 대조적으로, 13.5 밀리 와트의 기준 레이저 출력은 성공적인 폐색을 가져 왔습니다. 레이저 광응고 후 폐색의 네 가지 주요 유형이 발생합니다: 완전히 폐색된 혈관, 부분적으로 폐색된 혈관, 부분적으로 재관류된 혈관 및 완전히 재관류된 혈관.
타목시펜 유도성 내피 세포 Casp9 녹아웃 마우스의 조사된 혈관구조는 완전히 폐색된 상태에서 더 많은 시간을 보낸 C57 Black 6 마우스보다 부분적으로 재관류 및 부분적으로 폐색된 상태에서 더 많은 시간을 보냈습니다. 혈관의 폐색 상태는 레이저 광응고 후 처음 10분 이내에 빠르게 변하고 손상 후 24시간 후에 화염 모양의 출혈이 관찰됩니다. 망막 정맥 폐색 후 다른 안과 병리가 발생했습니다.
망막 정맥 폐색 후 망막 부종의 수준은 광학 간섭 단층 촬영 이미지를 사용하여 손상된 눈에서 정량화 할 수 있습니다. 신경 층의 상태는 또한 망막 내부 층의 해체를 평가하여 결정할 수 있습니다. 각 레이어에 해당하는 레이블이 있는 광학 간섭 단층 촬영 이미지의 예가 여기에 나와 있습니다.
기준 레이저 출력을 측정하는 것이 중요합니다. 이 판독값은 폐색의 성공에 큰 영향을 미치며 최적화할 수 있습니다. OCT, ERG 및 Optiger와 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다.
이것은 망막 신경 무결성 및 시각 경로 기능에 대한 신경 혈관 손상의 영향을 해결하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 신경 혈관 질환을 유발하는 분자 경로를 조사하는 길을 열어주고 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적함으로써 인간 질병에보다 쉽게 번역 될 수있는 데이터를 제공합니다.
