Nuestro equipo de investigación desarrolla tecnologías y protocolos para la microscopía crioelectrónica y la crioelectrónica. Hemos desarrollado protocolos para micromodelar cuadrículas TEM para dirigir el crecimiento celular y el posicionamiento para experimentos crio-ET. La crioelectrónica de células enteras se utiliza para producir estructuras de resolución a nivel nanométrico de complejos macromoleculares dentro de células preservadas en un estado hidratado congelado nativo.
El micropatronaje puede aumentar el rendimiento de los experimentos de crio-ET de células enteras, microscopía electrónica de luz crio-correlativa y fresado de haz de iones crioenfocado. El número y la distribución de células en las rejillas EM son cruciales para los estudios crio-ET de células enteras. Este protocolo proporciona un método rápido, reproducible y ampliamente adaptable para dirigir el crecimiento celular en las rejillas EM a través del micropatronaje.
El investigador debe sentirse cómodo usando pipetas, pinzas, técnicas básicas de cultivo celular y microscopios electrónicos de fluorescencia y transmisión. Cuando realice patrones por primera vez, use un tipo de célula bien conocido y una combinación de ECM y pruébelos en fundas o platos MatTek. Los miembros del equipo de investigación involucrados en el desarrollo de este protocolo son: Dr.
Brian Sibert, el Sr. Joseph Kim y el Dr. Jae Yang. Para comenzar, transfiera las rejillas a un soporte de preparación de la rejilla y descargue el carbono de las rejillas hacia arriba. A continuación, transfiera las rejillas con el lado de carbono hasta un portaobjetos de vidrio limpio o un deslizamiento con al menos una separación de un centímetro entre las rejillas.
Pipetear 10 microlitros de 0,05 poli-L-lisina en cada rejilla e incubar las rejillas en una cámara húmeda durante al menos 30 minutos. Después de la incubación, lave cada rejilla tres veces con 15 microlitros de HEPES molar 0.1 a pH 8.5. Incubar la rejilla en cada lavado durante 30 segundos, luego retirar la mayor parte del líquido de la rejilla con una pipeta sin dejar que la rejilla se seque.
Después del lavado final, dejar cada rejilla en 15 microlitros de HEPES de 0,1 molares. A continuación, prepare la solución PEG-SVA y reemplace inmediatamente la solución HEPES en las rejillas con 10 microlitros de la solución PEG-SVA, luego incube las rejillas en una cámara húmeda durante al menos una hora. Después de la incubación, lave cada rejilla tres veces con 15 microlitros de agua estéril, incubando la rejilla en cada lavado durante 30 segundos.
Después del lavado final, deje cada rejilla en 15 microlitros de agua. Coloque una gota de agua de un microlitro en el centro de una nueva cubierta limpia, luego transfiera cuidadosamente la rejilla de la gota de agua de 15 microlitros a la gota en la nueva cubierta con el lado de carbono hacia arriba. A continuación, coloque cuidadosamente en la plantilla PDMS sobre la rejilla manteniendo la rejilla centrada y minimizando el contacto de la plantilla con la lámina de carbono de la rejilla.
Luego agregue un microlitro de gel PLPP a la rejilla y pipete suavemente para mezclar. Mueva el recubierto con la rejilla a un lugar oscuro para que se seque. El gel se secará en 15 a 30 minutos.
Para el micropatronaje, abra el software con una vista Brightfield en vivo desde el microscopio. Para diseñar una nueva plantilla para una ejecución inicial, seleccione Agregar ROI y elija un círculo de 3.000 micrómetros. Coloque el ROI del círculo sobre la cuadrícula utilizando la imagen de Campo brillante en la pantalla como guía, luego presione Bloquear para asegurar el ROI.
Después de bloquear el ROI en su lugar, seleccione Agregar patrón y elija el patrón apropiado. Con las opciones de replicación, genere copias del patrón inicial para crear una región cuadrada de cuadrícula de ocho por ocho. Ajuste el espaciado y el ángulo según sea necesario para alinear los patrones con los cuadrados de la cuadrícula.
Coloque el patrón en una esquina de la cuadrícula. A continuación, duplique el patrón y coloque una copia en cada una de las cuatro esquinas de la cuadrícula moviendo la etapa del microscopio según sea necesario para cada región. Utilice las opciones de replicación para modificar una región cuadrada de cuadrícula de ocho por ocho en una región cuadrada de cuadrícula de dos por ocho que se colocará a ambos lados del centro.
Deje los cuatro cuadrados de cuadrícula centrales sin patrones. Para cada patrón, ajuste la dosis total si es necesario. 30 milijulios por milímetro cuadrado es un buen punto de partida.
En Opciones de expertos, itere ajustando el ángulo, la posición, el espacio entre y la proporción del patrón para refinar la alineación del patrón con los cuadrados de la cuadrícula. Mueva la etapa del microscopio para cambiar la región de la cuadrícula en la pantalla Brightfield. Una vez que la plantilla y los patrones estén posicionados, desmarque todas las regiones menos una en el panel de acción del software.
Use la etapa del microscopio para navegar a esa región y enfocarse en la lámina de carbono. Haga clic en el icono del globo ocular en el panel de acción para desactivar la visualización de superposición de patrones. Una vez que la cuadrícula esté enfocada, cierre el obturador Brightfield y presione el ícono Reproducir en la esquina inferior derecha del software para comenzar el proceso de modelado, que se puede monitorear en vivo.
Repita este paso hasta que todas las regiones estén modeladas. Finalmente, retire la cubierta con la rejilla del microscopio e inmediatamente agregue 10 microlitros de PBS estéril a la rejilla. Después de 10 minutos, retire la plantilla con pinzas, luego lave la rejilla tres veces con 15 microlitros de PBS y deje cada rejilla en PBS en un lugar oscuro.
Prepare 15 microlitros de la matriz extracelular para cada rejilla, luego reemplace el PBS de cada rejilla con 15 microlitros de la matriz extracelular e incube la rejilla en una cámara húmeda durante al menos una hora. Después de la incubación, lave cada rejilla cinco veces con 15 microlitros de PBS estéril como se demostró anteriormente. Después del lavado final, deje cada rejilla en PBS.
Usando un microscopio de fluorescencia, detecte el fluoróforo en la matriz extracelular para confirmar el patrón y que la lámina de carbono permanezca intacta. Las células HeLa sembradas en rejillas TEM micropatronadas y sin patrón son visibles mediante tinción fluorescente utilizando un ensayo de viabilidad celular basado en calceína AM y homodímero de etidio-1. Utilizando una matriz extracelular mixta de colágeno y fibrinógeno, las células HeLa se adhieren fácilmente a los patrones a través de la cuadrícula.
La morfología general de las células que se expandieron a lo largo del patrón es similar a la de las células cultivadas en cuadrículas sin patrones. Una imagen de Brightfield de células BEAS-2B infectadas por rsv 18 horas después de la siembra muestra la adhesión y el crecimiento celular a lo largo de la región central del patrón. La mayoría de las células infectadas se colocan a lo largo de la región central de mayor densidad del patrón de gradiente.
Las variantes del VSR se encuentran cerca de la periferia de las células BEAS-2B infectadas cultivadas en rejillas micromodeladas. Muchas proteínas estructurales del VSR se identifican dentro de los tomogramas, incluyendo la nucleocápside y la proteína de fusión viral. En las rejillas con micropatrones, las neuronas de Drosophila con expresión pan-neuronal de GFP pueden ser fácilmente rastreadas por microscopía de luz debido al etiquetado fluorescente y su ubicación dentro de los micropatrones.
Las neuronas en rejillas sin patrón también se pueden rastrear a través de la señalización GFP mediante microscopía de luz. Sin embargo, localizarlos en microscopía crioelectrónica se vuelve difícil debido a los desechos celulares y la contaminación de los medios. Debido a las dimensiones del cuerpo celular de la neurona y las neuritas extendidas, las series de inclinación de la tomografía crioelectrónica se recogen a lo largo de regiones más delgadas de las células con mayor aumento.
La membrana celular neuronal, las mitocondrias, los microtúbulos, los filamentos de actina, las estructuras vesiculares y las macromoléculas como los ribosomas están bien resueltas en montajes de imágenes de mayor aumento y cortes a través del tomograma 3D. Características subcelulares similares se observan a partir de tomogramas 3D de neuronas sin patrón. Aplicar la plantilla a la rejilla y agregar el gel PLPP es el paso más sensible que puede afectar los resultados del patrón y debe hacerse con precaución.
Cryo-CLEM se puede utilizar para localizar objetivos de interés dentro de las células para la recopilación de datos de crio-ET. Cryo-FIB-SEM se puede utilizar para diluir células en áreas que de otro modo serían demasiado gruesas para la recopilación de datos.
