Este video se centrará en la preparación de la levadura salmonella para la crio-tomografía electrónica Recorreremos el flujo de trabajo desde el cultivo celular hasta la crio-tomografía electrónica Saccharomyces cerevisiae se cultivan para la preparación de muestras de iones en suspensión Se recomienda trabajar en condiciones estériles dentro de la caja de flujo laminar diez mililitros de levadura estéril extraída al medio para el cultivo celular se agrega al matraz de cultivo esterilizado un mililitro de glucosa estéril del veinte por ciento el matraz con medio de cultivo una colonia de levadura se recoge cuidadosamente de nuestra placa de cultivo y se transfiere al medio de crecimiento preparado en el matraz de cultivo El matraz de cultivo se cubre con papel de aluminio y se mezcla bien para dispersar las células El cultivo celular se coloca en la incubadora y se cultiva a treinta grados con agitación constante hasta que se alcanza la fase exponencial El cultivo celular de levadura se cultiva hasta la fase exponencial y la densidad física celular se mide por Mantener el medidor contra un medio limpio como muestra de referencia El cultivo celular se concentra en OD1 u OD30 además del cinco por ciento de glicerol antes de la congelación por blanche La superficie de las rejillas electromicroscópicas se limpia y activa para la aplicación de la suspensión celular mediante rejillas de plasma se colocan en la cámara de descarga de resplandor mirando hacia arriba y el procedimiento de limpieza por plasma se establece en treinta a cuarenta y cinco segundos las rejillas EM tienen ahora y están listas para la celda Aplicación de muestra La vitrificación de la suspensión de células de levadura en rejillas EM se realiza mediante la congelación por blanca en el etano líquido utilizando la máquina Vitrobot La preparación del etano líquido se lleva a cabo licuando el gas etano en una taza de metal enfriada con nitrógeno líquido Em rejilla con suspensión celular se borra con papel de filtro de la parte posterior y por plástico no adhesivo doblado desde el lado frontal de carbono La temperatura dentro de la cámara Vitrobot se establece en dieciocho grados y humedad al cien por cien tiempo de espera, tiempo de borrado y fuerza de borrado también se establecen en la pantalla de Vitrobot La rejilla de descarga de resplandor es recogida por pinzas Vitrobot y montada en el instrumento tres punto cinco microlitros de saccharomyces cerevisiae suspensión se aplica al lado de carbono de la rejilla dentro de la cámara climática Vitrobot La suspensión debe mezclarse adecuadamente antes de que cada aplicación de la rejilla de la rejilla se congele con blanche en las rejillas de electro-microscopía de etano líquido las rejillas con células vitrificadas se almacenan en condiciones de nitrógeno líquido o se montan en el cartucho de rejilla para cargar en el microscopio CRIO SEM La rejilla con celdas vitrificadas se asegura en el cartucho de rejilla adecuado para cargar en los microscopios SEM y TEM El anillo de clip C se monta en la herramienta de recorte y se enfría en la rejilla de nitrógeno líquido se coloca en el cartucho de carbono de la rejilla hacia abajo y se recorta con el La muestra del anillo C-clip se coloca en la caja de rejilla especial La muestra para la preparación de lamila se carga en el microscopio FIB / SEM de doble haz y se ajusta con la cámara de preparación crioestafilada La olla de carga se enfría correctamente y se llena con un soporte de muestra de nitrógeno líquido llamado lanzadera se coloca en el y se enfría, así como la caja de rejilla con muestra se transfiere del dewar de almacenamiento a la olla y las rejillas se colocan en dos ranuras en el lado de carbono del transbordador con celdas hacia arriba en caso de uso de cartuchos de rejilla FIB, el corte del cartucho de rejilla debe alinearse cuidadosamente a las doce en punto en las rejillas de transporte se aprietan con el tornillo y el transbordador se voltea hacia abajo hasta la posición de carga, la olla de carga se coloca en la estación de transferencia y se cubre con la tapa La cámara de transferencia con la olla de carga se coloca en la parte superior de la tapa y se bombea a través de la El transbordador de bajo vacío con rejillas se sujeta en la varilla y se cierra dentro de la pequeña cámara de transferencia Las cámaras recogidas a la cámara de preparación se bombean y el transbordador se inserta en la etapa crio-etapa en la etapa de cámara SEM de alto vacío se inclina a cuarenta y cinco grados y se mueve cuatro milímetros en la posición central de la rejilla insertando la aguja del sistema de inyección de gas crea una capa protectora de orgánico sobre muestra biológica contra el daño por radiación durante el enfoque Las rejillas de fresado de vigas de iones se recubren con un velo delgado de metal inorgánico para crear una capa conductora en material biológico El fresado de vigas de iones enfocadas de láminas en racimo celular o monocapa se realiza en pocos pasos La etapa se mueve al ángulo de fresado Región de interés se encuentra y se crean patrones de fresado superior e inferior Se crean láminas rugosas se fresan con una disminución gradual de la corriente FIB y el espesor de la lámina el pulido final de la lámina es realizado solo con patrón superior y baja corriente FIB para evitar daños en el extremo frontal y efecto de cortina en el haz de electrones de la superficie de la lámina muestra el progreso durante el proceso de fresado aquí podemos ver la lámina pulida final El grosor final de la lámina debe ser inferior a doscientos cincuenta nanómetros para ser transparente para la transmisión del haz de electrones la ilustración de la lámina fresada en cúmulo celular y monocapa con pros y contras de Ambos tipos de muestras, las rejillas con lamali se transfieren muy suavemente a través de la cámara de preparación de regreso a la olla de carga, se enfrían y se llenan con nitrógeno líquido fresco y limpio para evitar la contaminación por hielo de las rejillas de lamali molidas, se retiran del transbordador y se devuelven a la muestra de la caja de rejilla con lamali fresado, finalmente se transfiere a la transmisión de electrones, la rejilla criociscópico debe girarse noventa grados antes de la inserción en el cassette del cargador automático TEM Para garantizar la orientación adecuada de la lámina con respecto al acceso de inclinación TEM, los lamili se examinan y la región de interés para la adquisición de datos tomográficos crioeónicos se localiza El eje principal de la lámina es perpendicular al eje de inclinación del microscopio para ver el campo de visión derecho en ángulos de inclinación altos Se utiliza el método dosimétrico para recopilar datos de tomografía crioetrónica recopilados el tomograma que luego se procesa en el software Etomo y la monocapa segmentada en Amira Software En este protocolo le mostramos cómo preparar eficientemente una muestra de células de levadura para una micromáquina de láminas utilizando fresado de haz de iones crioenfocado y cómo preparar y procesar datos de tomografía electrónica y lamali celular
