Las mitocondrias proporcionan energía celular a través de la fosforilación oxidativa que contribuye a casi todos los procesos dentro de la célula. En consecuencia, las disfunciones mitocondriales se asocian con un amplio espectro de enfermedades. La principal ventaja de esta técnica es la medición en tiempo real de la bioenergética mitocondrial por el consumo de oxígeno y, por lo tanto, una evaluación precisa del metabolismo energético celular total.
La respirometría de alta resolución permite la evaluación directa de lo que en el sistema de fosforilación oxidativa está fallando, lo que potencialmente proporciona pistas de diagnóstico en enfermedades mitocondriales primarias y disfunciones mitocondriales secundarias asociadas con muchos trastornos. Demostrando el procedimiento estará Ryan Awadhpersad, estudiante de doctorado en mi laboratorio. Para comenzar, realice la calibración de oxígeno ejecutando los respirómetros en 2.1 mililitros de medio de respiración mitocondrial a 37 grados Celsius durante más de 45 minutos y proceda si la variación basal está dentro de los cuatro picomoles por segundo.
Cultive células HEK293 en DMEM de alta glucosa suplementadas con FBS activado por calor al 10%, GlutaMAX, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio y uridina en una incubadora a 37 grados Celsius al 5% de dióxido de carbono. El día del experimento, recolectar y contar las células y resuspender 2,5 millones de células en un medio de respiración de 2,5 mililitros. Para evaluar la respiración de rutina, agregue 2,3 mililitros de suspensión de células medianas de respiración caliente a la cámara.
Haga funcionar las cámaras a 37 grados centígrados y una velocidad de agitación de 700 RPM. Espere al menos tres minutos para permitir que los medios se desgasifiquen, luego cierre las cámaras girando el tapón en un movimiento giratorio. A continuación, aspire el exceso de líquido en la parte superior del tapón.
Después de 10 minutos, obtenga una señal de flujo de oxígeno estable para registrar la respiración de rutina o estado I. Para realizar el análisis OXPHOS en células intactas, agregue dos microlitros de oligomicina 0.01-milimolar para una concentración final de 10-nanomolar. Valore FCCP a partir de material de dos milimolares agregando 0.6 microlitros a pasos de 0.2 microlitros hasta que no se observe un aumento en la respiración y la respiración esté desacoplada al máximo.
A continuación, agregue un microlitro de rotenona de un milimolar para una concentración final de 0.5 micromolares. Luego, agregue dos microlitros de un miligramo por mililitro de antimicina para una concentración final de un microgramo por mililitro. Reoxigeneizar la cámara al mismo nivel de oxígeno, aproximadamente 150 micromolares, levantando el émbolo.
Después, agregue cinco microlitros de ascorbato 0.8 molar para una concentración final de dos milimolares. Luego, agregue inmediatamente cinco microlitros de TMPD de 0.2 molares para una concentración final de 0.5 milimolares y evalúe la actividad IV compleja. A medida que se alcanza el flujo máximo de oxígeno con TMPD, agregue cinco microlitros o azida de cuatro molares para una concentración final de 10 milimolares.
Luego, continúe la ejecución durante al menos cinco minutos para evaluar la autooxidación de TMPD para el cálculo del nivel base IV complejo. Después de la ejecución, recoja un mililitro de suspensión de muestra de cada cámara y centrífuga a 1.000 G para las células permeabilizadas o a 20.000 G para el lisado tisular. Luego, deseche el sobrenadante y congele el pellet a menos 80 grados Celsius para un análisis posterior posterior.
Primero, sembra las células de acuerdo con las tasas de crecimiento de las líneas celulares individuales. Diluya oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina en tres microlitros de medio de ensayo hasta una concentración final de 1.5-micromolar, 1.125-micromolar y un micromolar, respectivamente. Posteriormente, llénelos en puertos separados.
Observe los puertos de inyección para garantizar una carga uniforme de las muestras. Encienda el sistema basado en microplacas y la computadora y equilibre a 37 grados centígrados durante al menos tres horas. El día del ensayo basado en microplacas, verifique la confluencia de la placa de cultivo celular, la morfología de las células y asegúrese de que los pozos de fondo estén vacíos.
Luego, retire todo excepto 20 microlitros del medio de cultivo de cada pozo. Luego, lave cada pozo con 90 microlitros de medio de ensayo y agregue 100 microlitros de medio de ensayo para hacer un volumen final de hasta 120 microlitros. A continuación, incube la placa a 37 grados centígrados en una incubadora sin dióxido de carbono durante 60 minutos.
Después de recuperar la placa de la incubadora, retire la tapa y coloque la microplaca en la ranura. Haga clic en Continuar para iniciar la ejecución. Una vez finalizada la ejecución, saque la placa y retire los medios de ensayo restantes sin perturbar las células.
Luego, congele toda la placa a menos 80 grados centígrados. Después de realizar los experimentos de permeabilización y respiración de digitoninas, se registraron trazas de consumo de oxígeno crudo de células HEK293 de tipo salvaje y células HEK293 con un knockout de genes mediado por CRISPR que resultó en múltiples deficiencias de OXPHOS. Se obtuvieron trazas de consumo de oxígeno normalizado de entrada celular superpuesta.
CRISPR knockout 1 muestra alteración de la respiración y CRISPR knockout 2 no muestra respiración en comparación con el tipo salvaje cuando se normaliza al número de célula. Se cuantificaron las cantidades de proteínas y se normalizaron los valores de respiración a la cantidad de proteínas para determinar los valores absolutos de los estados respiratorios y las respectivas relaciones de control de flujo. Se encontró que las tasas de acidificación extracelular aumentaron para la deficiencia de OXPHOS en CRISPR knockout 2, lo que sugiere una compensación de la deficiencia de fosforilación oxidativa mitocondrial en las células HEK293 a través de una mayor glucólisis.
Además, los valores de respiración se determinaron en presencia de oligomicina, FCCP y rotenona, y los valores obtenidos se normalizaron a la cantidad de proteína. Se estudiaron trazas de consumo de oxígeno normalizado por proteínas de células HEK293 de tipo salvaje y células HEK293 con deficiencia de traducción mitocondrial mediada por CRISPR que causa deficiencia múltiple de OXPHOS. Se obtuvieron trazas de consumo de oxígeno normalizado por tejido de peso húmedo del cerebelo del ratón y del músculo del sóleo del ratón.
Los músculos del sóleo muestran una oxfosa y una capacidad respiratoria tres veces mayor que el cerebelo. Con la respirometría basada en cámara, es importante trabajar rápido, ya que la función mitocondrial disminuirá en el momento en que recolecte sus muestras, y con la respirometría basada en placas, es crucial adquirir una densidad de siembra óptima para minimizar la variabilidad. Para un análisis más detallado, es posible la cuantificación de proteínas o el inmuno-blotting.
Esto podría determinar si una alteración en la función respiratoria mitocondrial se debió a la abundancia de complejos OXPHOS o a la cantidad mitocondrial. Ya hace un siglo, se descubrió que las células cancerosas realizaban glucólisis anaeróbica además del OXPHOS mitocondrial. Esto subraya la necesidad de ensayar la bioenergética mitocondrial.
Aquí demostramos dos respirómetros considerados el estándar de oro de hoy.
