Mitochondrien liefern zelluläre Energie durch oxidative Phosphorylierung, die zu fast allen Prozessen innerhalb der Zelle beiträgt. Folglich sind mitochondriale Funktionsstörungen mit einem breiten Spektrum von Krankheiten verbunden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Echtzeitmessung der mitochondrialen Bioenergetik durch Sauerstoffverbrauch und damit eine genaue Bewertung des gesamten zellulären Energiestoffwechsels.
Die hochauflösende Respirometrie ermöglicht eine direkte Beurteilung dessen, was im oxidativen Phosphorylierungssystem versagt, und liefert möglicherweise diagnostische Hinweise bei primären mitochondrialen Erkrankungen und sekundären mitochondrialen Dysfunktionen, die mit vielen Erkrankungen verbunden sind. Das Verfahren wird von Ryan Awadhpersad, Doktorand in meinem Labor, demonstriert. Führen Sie zunächst die Sauerstoffkalibrierung durch, indem Sie die Respirometer länger als 45 Minuten in 2,1 Millilitern mitochondrialem Atmungsmedium bei 37 Grad Celsius laufen lassen und fortfahren, wenn die Basislinienvariation innerhalb von vier Picomolen pro Sekunde liegt.
Kultur HEK293-Zellen in hohem Glukose-DMEM, ergänzt mit 10% hitzeaktiviertem FBS, GlutaMAX, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat und Uridin in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius bei 5% Kohlendioxid. Sammeln und zählen Sie am Tag des Experiments die Zellen und resuspendieren Sie 2,5 Millionen Zellen in 2,5 Milliliter Atmungsmedium. Um die routinemäßige Atmung zu beurteilen, fügen Sie der Kammer 2,3 Milliliter warme Atmungsmediumzellsuspension hinzu.
Laufen Sie die Kammern bei 37 Grad Celsius und einer Rührgeschwindigkeit von 700 U / min. Warten Sie mindestens drei Minuten, bis die Medien entgasen können, und schließen Sie dann die Kammern, indem Sie den Stopfen in einer rotierenden Bewegung drehen. Als nächstes saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit auf den Stopfen.
Erhalten Sie nach 10 Minuten ein stabiles Sauerstoffflusssignal, um die Routine- oder Zustandsatmung aufzuzeichnen. Um eine OXPHOS-Analyse in intakten Zellen durchzuführen, fügen Sie zwei Mikroliter 0,01-millimolares Oligomycin für eine Endkonzentration von 10-Nanomolar hinzu. Titrieren Sie FCCP aus dem Zwei-Millimol-Bestand, indem Sie 0,6 Mikroliter bei 0,2-Mikroliter-Schritten hinzufügen, bis kein Anstieg der Atmung beobachtet wird und die Atmung maximal entkoppelt ist.
Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter einmillimolares Rotenon für eine Endkonzentration von 0,5-Mikromolar hinzu. Dann fügen Sie zwei Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Antimycin-Vorrat für eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Reoxygenieren Sie die Kammer auf den gleichen Sauerstoffgehalt, etwa 150 Mikromolaren, indem Sie den Kolben anheben.
Danach fügen Sie fünf Mikroliter 0,8-molares Ascorbat für eine Endkonzentration von zwei Millimolaren hinzu. Fügen Sie dann sofort fünf Mikroliter 0,2-molar TMPD für eine Endkonzentration von 0,5-Millimolar hinzu und bewerten Sie die komplexe IV-Aktivität. Wenn der maximale Sauerstofffluss mit TMPD erreicht ist, fügen Sie fünf Mikroliter oder viermolares Azid für eine Endkonzentration von 10-Millimolar hinzu.
Setzen Sie dann den Lauf für mindestens fünf Minuten fort, um die automatische Oxidation von TMPD für die Berechnung des komplexen IV-Basisniveaus zu untersuchen. Nach dem Durchlauf einen Milliliter Probensuspension aus jeder Kammer sammeln und zentrifugieren Sie bei 1.000 G für permeabilisierte Zellen oder bei 20.000 G für Gewebelysat. Verwerfen Sie dann den Überstand und frieren Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius für die weitere nachgelagerte Analyse ein.
Samen Sie zunächst die Zellen entsprechend den Wachstumsraten einzelner Zelllinien. Verdünnen Sie Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin in drei Mikrolitern Assay-Medium zu einer Endkonzentration von 1,5-Mikromolaren, 1,125-Mikromolaren bzw. Ein-Mikromolaren. Füllen Sie sie anschließend in separate Ports.
Beachten Sie die Injektionsanschlüsse, um eine gleichmäßige Beladung der Proben zu gewährleisten. Schalten Sie das auf Mikrotiterplatten basierende System und den Computer ein und gleichen Sie sie mindestens drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius aus. Überprüfen Sie am Tag des auf Mikrotiterplatten basierenden Assays die Konfluenz der Zellkulturplatte, die Morphologie der Zellen und stellen Sie sicher, dass die Hintergrundvertiefungen leer sind.
Entfernen Sie dann alles außer 20 Mikrolitern des Kulturmediums aus jedem Brunnen. Waschen Sie dann jedes Gut mit 90 Mikrolitern Assay-Medium und fügen Sie 100 Mikroliter Assay-Medium hinzu, um ein Endvolumen von bis zu 120 Mikrolitern zu erhalten. Als nächstes inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator ohne Kohlendioxid für 60 Minuten.
Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator geholt haben, entfernen Sie den Deckel und legen Sie die Mikroplatte in den Schlitz. Klicken Sie auf Weiter, um den Lauf zu starten. Nachdem der Durchlauf beendet ist, nehmen Sie die Platte heraus und entfernen Sie die verbleibenden Assay-Medien, ohne die Zellen zu stören.
Dann frieren Sie die gesamte Platte bei minus 80 Grad Celsius ein. Nach der Durchführung der Digitonin-Permeabilisierungs- und Atmungsexperimente wurden Spuren des Rohsauerstoffverbrauchs von Wildtyp-HEK293-Zellen und HEK293-Zellen mit einem CRISPR-vermittelten Gen-Knockout aufgezeichnet, was zu mehreren OXPHOS-Mängeln führte. Überlagerte Zellinput-normalisierte Sauerstoffverbrauchsspuren wurden erhalten.
CRISPR-Knockout 1 zeigt eine beeinträchtigte Atmung und CRISPR-Knockout 2 zeigt keine Atmung im Vergleich zum Wildtyp, wenn es auf die Zellzahl normalisiert wird. Proteinmengen wurden quantifiziert und die Atmungswerte auf Proteinmenge normalisiert, um absolute Werte der Atemzustände und entsprechende Flusskontrollverhältnisse zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die extrazellulären Versauerungsraten für OXPHOS-Mangel bei CRISPR-Knockout 2 ansteigen, was auf eine Kompensation des mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungsmangels in HEK293-Zellen durch erhöhte Glykolyse hindeutet.
Darüber hinaus wurden die Atmungswerte in Gegenwart von Oligomycin, FCCP und Rotenon bestimmt, und die erhaltenen Werte wurden auf die Proteinmenge normalisiert. Protein-normalisierte Sauerstoffverbrauchsspuren von Wildtyp-HEK293-Zellen und HEK293-Zellen mit CRISPR-vermitteltem mitochondrialem Translationsmangel, der einen multiplen OXPHOS-Mangel verursacht, wurden untersucht. Nassgewichts-Gewebe-normalisierte Sauerstoffverbrauchsspuren von Maus-Kleinhirn und Maus-Soleus-Muskel wurden erhalten.
Die Soleusmuskeln zeigen eine dreimal höhere OXPHOS- und Atmungskapazität als das Kleinhirn. Bei der kammerbasierten Respirometrie ist es wichtig, schnell zu arbeiten, da die mitochondriale Funktion in dem Moment abnimmt, in dem Sie Ihre Proben sammeln, und bei der plattenbasierten Respirometrie ist es wichtig, eine optimale Aussaatdichte zu erreichen, um die Variabilität zu minimieren. Zur weiteren Analyse ist eine Proteinquantifizierung oder Immunblottierung möglich.
Dies könnte feststellen, ob eine Veränderung der mitochondrialen Atmungsfunktion auf die Häufigkeit von OXPHOS-Komplexen oder die mitochondriale Menge zurückzuführen ist. Bereits vor einem Jahrhundert wurde festgestellt, dass Krebszellen zusätzlich zu mitochondrialem OXPHOS eine anaerobe Glykolyse durchführen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, die mitochondriale Bioenergetik zu untersuchen.
Hier demonstrierten wir zwei Respirometer, die als heutiger Goldstandard gelten.
