Mitokondri, hücre içindeki hemen hemen tüm işlemlere katkıda bulunan oksidatif fosforilasyon yoluyla hücresel enerji sağlar. Sonuç olarak, mitokondriyal disfonksiyonlar geniş bir hastalık yelpazesi ile ilişkilidir. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondriyal biyoenerjetik maddelerin oksijen tüketimi ile gerçek zamanlı olarak ölçülmesi ve böylece toplam hücresel enerji metabolizmasının doğru bir şekilde değerlendirilmesidir.
Yüksek çözünürlüklü respirometri, oksidatif fosforilasyon sisteminde neyin başarısız olduğunun doğrudan değerlendirilmesine izin verir, potansiyel olarak birincil mitokondriyal hastalıklarda ve birçok bozuklukla ilişkili sekonder mitokondriyal disfonksiyonlarda tanısal ipuçları sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Ryan Awadhpersad olacak. Başlamak için, respirometreleri 2.1 mililitre mitokondriyal solunum ortamında 37 santigrat derecede 45 dakikadan fazla çalıştırarak oksijen kalibrasyonunu gerçekleştirin ve temel varyasyon saniyede dört pikomol içindeyse devam edin.
Yüksek glikozlu DMEM'deki kültür HEK293 hücreleri,% 10 ısıl aktive FBS, GlutaMAX, esansiyel olmayan amino asitler, sodyum piruvat ve idrar ile desteklenmiştir 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte. Deney gününde, hücreleri toplayıp sayın ve 2,5 mililitre solunum ortamında 2,5 milyon hücreyi yeniden askıya alın. Rutin solunumu değerlendirmek için, odaya 2.3 mililitre sıcak solunum orta hücre süspansiyonu ekleyin.
Odaları 37 santigrat derecede ve 700 RPM'lik bir karıştırma hızında çalıştırın. Ortamın gazdan arındırılmasına izin vermek için en az üç dakika bekleyin, ardından durdurucuyu dönen bir hareketle döndürerek odaları kapatın. Daha sonra, tıpanın üstündeki fazla sıvıyı aspire edin.
10 dakika sonra, rutin veya durum I solunumu kaydetmek için sabit bir oksijen akısı sinyali alın. Sağlam hücrelerde OXPHOS analizi yapmak için, 10-nanomolar'ın son konsantrasyonu için iki mikrolitre 0.01-milimolar oligomisin ekleyin. FCCP'yi iki milimolar stoktan titre ederek 0.2 mikrolitrelik adımlarda 0.6 mikrolitre ekleyerek solunumda herhangi bir artış gözlenmez ve solunum maksimum olarak ayrılır.
Daha sonra, 0.5 mikromolar'lık son bir konsantrasyon için bir mikrolitre bir milimolar rotenon ekleyin. Daha sonra, mililitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyon için mililitre antimisin stoğu başına bir miligramlık iki mikrolitre ekleyin. Pistonu kaldırarak odayı aynı oksijen seviyesine, yaklaşık 150 mikromolara kadar yeniden oksijenlendirin.
Daha sonra, iki milimolar'ın son konsantrasyonu için beş mikrolitre 0.8 molar askorbat ekleyin. Daha sonra, 0.5 milimolarlık bir son konsantrasyon için derhal beş mikrolitre 0.2-molar TMPD ekleyin ve kompleks IV aktivitesini değerlendirin. TMPD ile tepe oksijen akısına ulaşıldığında, 10 milimolar'lık son bir konsantrasyon için beş mikrolitre veya dört molar azid ekleyin.
Ardından, karmaşık IV baz seviyesi hesaplaması için TMPD'nin otomatik oksidasyonunu test etmek üzere en az beş dakika boyunca çalışmaya devam edin. Çalıştırmadan sonra, her odadan bir mililitre numune süspansiyonu toplayın ve geçirgenleştirilmiş hücreler için 1.000 G'de veya doku lizatı için 20.000 G'de santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı atın ve daha fazla aşağı akış analizi için peleti eksi 80 santigrat derecede dondurun.
İlk olarak, hücreleri bireysel hücre hatlarının büyüme oranlarına göre tohumlayın. Oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin'i üç mikrolitre tahlil ortamında sırasıyla 1.5-mikromolar, 1.125-mikromolar ve bir mikromolar nihai konsantrasyonuna kadar seyreltin. Daha sonra, bunları ayrı bağlantı noktalarına doldurun.
Numunelerin eşit bir şekilde yüklenmesini sağlamak için enjeksiyon portlarını gözlemleyin. Mikroplaka tabanlı sistemi ve bilgisayarı açın ve en az üç saat boyunca 37 santigrat derecede dengeleyin. Mikroplaka bazlı tahlil gününde, hücre kültürü plakasının akıcılığını, hücrelerin morfolojisini doğrulayın ve arka plan kuyularının boş olduğundan emin olun.
Ardından, her bir kuyucuktan 20 mikrolitre kültür ortamı dışındaki her şeyi çıkarın. Daha sonra, her bir kuyucuğu 90 mikrolitre tahlil ortamı ile yıkayın ve 120 mikrolitreye kadar nihai bir hacim yapmak için 100 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Daha sonra, plakayı 60 dakika boyunca karbondioksitsiz bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Plakayı inkübatörden aldıktan sonra, kapağı çıkarın ve mikro plakayı yuvaya yerleştirin. Çalıştırmayı başlatmak için Devam'a tıklayın. Çalıştırma bittikten sonra, plakayı çıkarın ve hücreleri rahatsız etmeden kalan tahlil ortamını çıkarın.
Ardından, tüm plakayı eksi 80 santigrat derecede dondurun. Digitonin geçirgenlik ve solunum deneyleri yapıldıktan sonra, vahşi tip HEK293 hücrelerinin ve CRISPR aracılı gen nakavtına sahip HEK293 hücrelerinin ham oksijen tüketim izleri kaydedildi ve çoklu OXPHOS eksikliklerine neden oldu. Üst üste binmiş hücre girişi normalleştirilmiş oksijen tüketim izleri elde edildi.
CRISPR nakavt 1, bozulmuş solunum, CRISPR nakavt 2, hücre numarasına normalleştirildiğinde vahşi tipe kıyasla solunum göstermez. Solunum durumlarının mutlak değerlerini ve ilgili akı kontrol oranlarını belirlemek için protein miktarları ölçüldü ve solunum değerleri protein miktarına normalleştirildi. CRISPR nakavt 2'de OXPHOS eksikliği için hücre dışı asitleşme oranlarının arttığı bulunmuştur, bu da HEK293 hücrelerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyon eksikliğinin artmış glikoliz yoluyla telafi edildiğini düşündürmektedir.
Ayrıca solunum değerleri oligomisin, FCCP ve rotenon varlığında belirlendi ve elde edilen değerler protein miktarına normalleştirildi. Çoklu OXPHOS eksikliğine neden olan CRISPR aracılı mitokondriyal translasyon eksikliği olan vahşi tip HEK293 hücrelerinin ve HEK293 hücrelerinin protein normalize oksijen tüketimi izleri incelenmiştir. Islak ağırlıkta doku normalize oksijen tüketimi ile fare beyinciği ve fare soleus kası izleri elde edildi.
Soleus kasları, beyincikten üç kat daha yüksek OXPHOS ve solunum kapasitesi gösterir. Oda bazlı respirometri ile hızlı çalışmak önemlidir, çünkü numunelerinizi topladığınız anda mitokondriyal fonksiyon azalacaktır ve plaka bazlı respirometri ile değişkenliği en aza indirmek için optimum tohumlama yoğunluğu elde etmek çok önemlidir. Daha fazla analiz için, protein niceliği veya immüno-lekelenme mümkündür.
Bu, mitokondriyal solunum fonksiyonundaki bir değişikliğin OXPHOS komplekslerinin bolluğundan mı yoksa mitokondriyal miktardan mı kaynaklandığını belirleyebilir. Zaten bir yüzyıl önce, kanser hücrelerinin mitokondriyal OXPHOS'a ek olarak anaerobik glikoliz gerçekleştirdiği bulundu. Bu, mitokondriyal biyoenerjetik testleri test etme ihtiyacının altını çizmektedir.
Burada bugünün altın standardı olarak kabul edilen iki respirometreyi gösterdik.
