המיטוכונדריה מספקת אנרגיה תאית באמצעות זרחון חמצוני התורם כמעט לכל התהליכים בתוך התא. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור לספקטרום רחב של מחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מדידה בזמן אמת של ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית על ידי צריכת חמצן, ובכך, הערכה מדויקת של חילוף החומרים הכולל של האנרגיה התאית.
נשימה ברזולוציה גבוהה מאפשרת הערכה ישירה של מה שבמערכת הזרחון החמצוני נכשל, מה שעשוי לספק רמזים אבחנתיים במחלות מיטוכונדריאליות ראשוניות ותפקוד לקויות משניות של המיטוכונדריה הקשורות להפרעות רבות. מי שידגים את ההליך יהיה ריאן אוואדהפרסאד, דוקטורנט במעבדה שלי. כדי להתחיל, לבצע את כיול החמצן על ידי הפעלת respirometers ב 2.1 מיליליטרים של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי ב 37 מעלות צלזיוס במשך יותר מ 45 דקות ולהמשיך אם השינוי הבסיסי הוא בתוך ארבעה picomoles לשנייה.
תאי HEK293 בתרבית ב-DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 10% FBS המופעלת על ידי חום, גלוטמקס, חומצות אמינו לא חיוניות, נתרן פירובט ואורידין באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני. ביום הניסוי, אספו וספרו את התאים והחזירו 2.5 מיליון תאים במדיום נשימה של 2.5 מיליליטרים. כדי להעריך את הנשימה השגרתית, הוסיפו 2.3 מיליליטרים של תרחיף תא בינוני לנשימה חמה לתא.
הפעילו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ובמהירות ערבוב של 700 סל"ד. המתן לפחות שלוש דקות כדי לאפשר לתקשורת להתרוקן מהגז, ואז סגור את התאים על ידי סיבוב הפקק בתנועה מסתובבת. לאחר מכן, לשאוף את הנוזל העודף על גבי הפקק.
לאחר 10 דקות, קבל אות שטף חמצן יציב כדי להקליט שגרה או מצב הנשימה שלי. כדי לבצע ניתוח OXPHOS בתאים שלמים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של אוליגומיצין 0.01-מילימולר לריכוז סופי של 10-ננומולאר. Titrate FCCP ממלאי של שני מילימולרים על ידי הוספת 0.6 מיקרוליטרים בצעדים של 0.2 מיקרוליטר עד שלא נצפתה עלייה בנשימה והנשימה אינה מתואמת באופן מקסימלי.
לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של רוטנון מילימולרי אחד לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מלאי אנטימיצין אחד למיליליטר לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. יאוקסיגנסציה מחדש של התא לאותה רמת חמצן, כ-150 מיקרומולר, על ידי הרמת הבוכנה.
לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של אסקורבט טוחנות 0.8 לריכוז סופי של שני מילימולרים. לאחר מכן, מיד להוסיף חמישה microliters של 0.2-טוחנת TMPD עבור ריכוז סופי של 0.5-millimolar ולהעריך פעילות IV מורכב. כאשר מגיעים לשיא שטף החמצן עם TMPD, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים או אזיד ארבע טוחנות לריכוז סופי של 10 מילימולאר.
לאחר מכן, המשך את הריצה במשך חמש דקות לפחות כדי לבחון חמצון אוטומטי של TMPD לצורך חישוב רמת בסיס IV מורכב. לאחר הריצה, לאסוף מיליליטר אחד של תרחיף דגימה מכל תא וצנטריפוגה ב 1, 000 G עבור תאים permeabilized או ב 20, 000 G עבור ליזוז רקמה. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח נוסף במורד הזרם.
ראשית, זרעו את התאים על פי קצבי הגדילה של קווי תאים בודדים. אוליגומיצין מדולל, FCCP, רוטנון ואנטימיצין בשלושה מיקרוליטרים של מדיום בדיקה עד לריכוז סופי של 1.5 מיקרומולר, 1.125-מיקרומולר ומיקרומולר אחד, בהתאמה. לאחר מכן, מלא אותם ליציאות נפרדות.
שימו לב ליציאות ההזרקה כדי להבטיח טעינה אחידה של הדגימות. הפעילו את המערכת והמחשב המבוססים על מיקרו-לוחות ושיזבו אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות. ביום הבדיקה המבוססת על מיקרו-פלטה, אמתו את המפגש של צלחת תרבית התאים, את המורפולוגיה של התאים, וודאו כי בארות הרקע ריקות.
לאחר מכן, הסר הכל מלבד 20 מיקרוליטרים של מדיום התרבית מכל באר. לאחר מכן, שטפו כל באר עם 90 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה והוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום בדיקה כדי ליצור נפח סופי של עד 120 מיקרוליטרים. לאחר מכן, לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא פחמן דו חמצני במשך 60 דקות.
לאחר שליפת הצלחת מהאינקובטור, הסר את המכסה והנח את המיקרו-פלטה בחריץ. לחץ על המשך כדי להתחיל את הריצה. לאחר סיום הריצה, הוציאו את הצלחת והסירו את אמצעי הבדיקה הנותרים מבלי להפריע לתאים.
לאחר מכן, הקפיאו את הצלחת כולה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ביצוע ניסויי החדירה והנשימה של דיגיטיונין, נרשמו עקבות צריכת חמצן גולמית של תאי HEK293 מסוג פראי ותאי HEK293 עם נוקאאוט גנים בתיווך קריספר וכתוצאה מכך תועדו ליקויים מרובים ב-OXPHOS. התקבלו עקבות צריכת חמצן מנורמלים של קלט תאי שכבת-על.
נוקאאוט קריספר 1 מראה נשימה לקויה ונוקאאוט קריספר 2 לא מראה שום נשימה בהשוואה לסוג פראי כאשר הוא מנורמל למספר התא. כמויות החלבון כומתו וערכי הנשימה נורמלו לכמות החלבון על מנת לקבוע ערכים מוחלטים של מצבי נשימה ויחסי בקרת שטף בהתאמה. נמצא כי שיעורי ההחמצה החוץ-תאית עלו בגין מחסור ב-OXPHOS בנוקאאוט 2 של קריספר, מה שמרמז על פיצוי על מחסור בזרחון חמצוני מיטוכונדריאלי בתאי HEK293 באמצעות גליקוליזה מוגברת.
בנוסף, ערכי הנשימה נקבעו בנוכחות אוליגומיצין, FCCP ורוטנון, והערכים שהתקבלו נורמלו לכמות החלבון. נחקרו עקבות של צריכת חמצן מנורמלת חלבונים של תאי HEK293 מסוג בר ותאי HEK293 עם מחסור בתרגום מיטוכונדריאלי בתיווך קריספר, הגורם למחסור רב ב-OXPHOS. התקבלו עקבות צריכת חמצן מנורמלים של רקמות במשקל רטוב של המוח הקטן של העכבר ושריר הסולאוס של העכבר.
שרירי הסולאוס מראים פי שלושה יותר OXPHOS ויכולת נשימה מאשר המוח הקטן. עם נשימה מבוססת תא, חשוב לעבוד מהר, מכיוון שתפקוד המיטוכונדריה תפחת ברגע שאתה אוסף את הדגימות שלך, ועם נשימה מבוססת צלחת, חיוני לרכוש צפיפות זריעה אופטימלית כדי למזער את השונות. לצורך ניתוח נוסף, כימות חלבונים או כתם חיסוני אפשרי.
זה יכול לקבוע אם שינוי בתפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי נבע משפע של קומפלקסים OXPHOS או כמות המיטוכונדריה. כבר לפני מאה שנה נמצא כי תאים סרטניים מבצעים גליקוליזה אנאירובית בנוסף ל-OXPHOS המיטוכונדריאלי. זה מדגיש את הצורך לבחון ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית.
כאן הדגמנו שני מדים שנחשבים לתקן הזהב של היום.
