ミトコンドリアは、細胞内のほぼすべてのプロセスに寄与する酸化的リン酸化を介して細胞エネルギーを提供する。その結果、ミトコンドリアの機能不全は、広範囲の疾患と関連している。この技術の主な利点は、酸素消費によるミトコンドリア生体エネルギー学のリアルタイム測定、したがって、全細胞エネルギー代謝の正確な評価である。
高分解能呼吸法は、酸化的リン酸化系で何が失敗しているかを直接評価することを可能にし、多くの障害に関連する原発性ミトコンドリア疾患および二次ミトコンドリア機能障害における診断的手がかりを提供する可能性がある。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるRyan Awadhpersadです。まず、2.1ミリリットルのミトコンドリア呼吸培地で呼吸計を摂氏37度で45分以上実行して酸素校正を行い、ベースライン変動が毎秒4ピコモール以内であれば続行します。
HEK293細胞を、10%熱活性化FBS、GlutaMAX、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびウリジンを添加した高グルコースDMEM中で、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーター内で培養する。実験当日、細胞を採取・計数し、250万個の細胞を2.5ミリリットルの呼吸培地に再懸濁した。日常的な呼吸を評価するために、2.3ミリリットルの温呼吸培地細胞懸濁液をチャンバーに加える。
チャンバーを摂氏 37 度、攪拌速度 700 RPM で実行します。メディアがガス抜きになるまで少なくとも3分間待ってから、ストッパーを回転運動でねじってチャンバーを閉じます。次に、余分な液体をストッパーの上に吸引する。
10分後、呼吸のルーチンまたは状態Iを記録するために安定した酸素流束信号を得る。インタクトな細胞でOXPHOS分析を実行するには、2マイクロリットルの0.01-ミリモルオリゴマイシンを最終濃度10-ナノモルで加える。呼吸の増加が観察されず、呼吸が最大限に結合解除されるまで、0.2マイクロリットルのステップで0.6マイクロリットルを加えて、2ミリモルのストックからFCCPを滴定する。
次に、1マイクロリットルの1ミリモルのロテノンを最終濃度0.5マイクロモルで加える。次いで、1ミリリットル当たり1マイクログラムの抗マイシンストックを2マイクロリットル加え、最終濃度は1ミリリットル当たり1マイクログラムである。プランジャーを持ち上げることによって、チャンバーを同じ酸素レベル(約150マイクロモル)に再酸素化します。
その後、5マイクロリットルの0.8モルのアスコルビン酸塩を加え、最終濃度が2ミリモルになる。次いで、直ちに5マイクロリットルの0.2モルTMPDを終濃度0.5ミリモル用に加え、複合体IV活性を評価した。TMPDでピーク酸素流束に達したら、5マイクロリットルまたは4モルのアジ化物を加え、最終濃度を10ミリモルにします。
次いで、複合体IV塩基レベル計算のためのTMPDの自己酸化をアッセイするために、少なくとも5分間実行を継続する。ランの後、各チャンバーから1ミリリットルのサンプル懸濁液を収集し、透過処理された細胞の場合は1,000Gで、組織溶解物の場合は20,000Gで遠心分離機で遠心分離します。その後、上清を捨て、ペレットをマイナス80°Cで凍結し、さらに下流の分析を行います。
まず、個々の細胞株の増殖速度に従って細胞を播種する。オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンを3マイクロリットルのアッセイ培地中で、それぞれ終濃度が1.5マイクロモル、1.125マイクロモル、および1マイクロモルになるように希釈する。その後、それらを別々のポートに入力します。
注入ポートを観察して、サンプルの均一な負荷を確保します。マイクロプレートベースのシステムとコンピュータの電源を入れ、摂氏37度で少なくとも3時間平衡化します。マイクロプレートベースのアッセイの日に、細胞培養プレートのコンフルエンシー、細胞の形態を確認し、バックグラウンドウェルが空であることを確認する。
次いで、各ウェルから20マイクロリットルの培養液を除くすべてを除去する。次いで、各ウェルを90マイクロリットルのアッセイ培地で洗浄し、100マイクロリットルのアッセイ培地を加えて、最大120マイクロリットルの最終容量を作る。次に、プレートを二酸化炭素なしでインキュベーター内で摂氏37度で60分間インキュベートする。
インキュベーターからプレートを取り出した後、蓋を外し、マイクロプレートをスロットに入れます。[続行]をクリックして実行を開始します。ランが終了したら、プレートを取り出し、細胞を乱すことなく残りのアッセイ培地を除去します。
次に、プレート全体をマイナス80°Cで凍結します。ジギトニン透過および呼吸実験を実施した後、複数のOXPHOS欠損をもたらすCRISPR媒介遺伝子ノックアウトを有する野生型HEK293細胞およびHEK293細胞の生酸素消費痕跡が記録された。重ね合わせたセル入力正規化された酸素消費トレースが得られた。
CRISPRノックアウト1は呼吸障害を示し、CRISPRノックアウト2は細胞数に正規化した場合、野生型と比較して呼吸を示さない。呼吸状態の絶対値およびそれぞれの流束制御比を決定するために、タンパク質量を定量化し、呼吸値をタンパク質量に正規化した。細胞外酸性化率は、CRISPRノックアウト2におけるOXPHOS欠損症に対して増加することが見出され、解糖系の増加によるHEK293細胞におけるミトコンドリア酸化的リン酸化欠損の補償が示唆された。
さらに、呼吸値はオリゴマイシン、FCCP、およびロテノンの存在下で決定し、得られた値をタンパク質量に正規化した。複数のOXPHOS欠損を引き起こすCRISPR媒介性ミトコンドリア翻訳欠損を有する野生型HEK293細胞およびHEK293細胞のタンパク質正規化酸素消費痕跡が研究された。湿重量組織正常化酸素消費量痕跡のマウス小脳およびマウスヒラメ筋が得られた。
ヒラメの筋肉は、小脳の3倍のOXPHOSと呼吸能力を示しています。チャンバーベースの呼吸法では、サンプルを採取した瞬間にミトコンドリアの機能が低下するため、迅速に作業することが重要であり、プレートベースの呼吸法では、変動を最小限に抑えるために最適な播種密度を獲得することが重要です。さらなる分析のために、タンパク質定量またはイムノブロッティングが可能である。
これにより、ミトコンドリア呼吸機能の変化がOXPHOS複合体の豊富さによるものか、ミトコンドリア量によるものかを判断することができる。すでに1世紀前、癌細胞はミトコンドリアOXPHOSに加えて嫌気性解糖系を行うことが見出された。これは、ミトコンドリア生体エネルギー学をアッセイする必要性を強調する。
ここでは、今日の金本位制と見なされる2つの呼吸計を実演しました。
