Este protocolo proporciona una técnica para detectar las proteínas salivales de los saltahojas y los huéspedes de plantas para investigar más a fondo la función de estas proteínas en los huéspedes de la planta. Esta técnica es fácil de realizar y el sistema es estable y replicable. Este método también podría ser útil en la detección de proteínas salivales de otros hemípteros y huéspedes vegetales.
Para comenzar, críe los saltahojas adultos en las plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 por 35 por 20 centímetros. Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación. Coloque las jaulas con los saltahojas en una incubadora que contenga un controlador de humedad incorporado a 26 grados centígrados con una humedad relativa del 60 al 75% bajo un período fotográfico de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad.
Una vez a la semana, use un aspirador para transferir suavemente a todos los adultos de su jaula a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz fresco. Permita que más de 200 adultos se apareen y pongan huevos en el arroz. Retenga las viejas plántulas de arroz para que emerjan las ninfas y críe a estas nuevas ninfas no virulíferas a la segunda etapa de estadio.
Usando el aspirador, transfiera cuidadosamente las ninfas no virulíferas del segundo estadio a un tubo de cultivo de vidrio durante una o dos horas para la inanición. Luego libere a las ninfas en una jaula que contenga una planta de arroz infectada con el virus enano del arroz cultivada en una maceta y permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante dos días. Después de dos días, transfiera cuidadosamente estas ninfas a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz frescas libres de virus, y permita que las ninfas se alimenten de las plántulas de arroz libres de virus durante 12 días para completar el período de transmisión circulativa del virus enano del arroz.
Para recolectar las proteínas salivales, prepare cinco pequeñas jaulas de alimentación en forma de tubería cubiertas con redes a prueba de insectos en un extremo. Después de confinar de 15 a 20 saltahojas en cada jaula de alimentación, cubra el otro extremo de la jaula con una estera de espuma delgada. Fije una plántula de arroz entre el extremo de la jaula y una estera de espuma con cintas, asegurándose de que los saltahojas en la jaula de alimentación puedan alimentarse de las plántulas de arroz expuestas al interior de la jaula.
Sumerja las raíces de las plántulas en agua para que la planta de arroz permanezca viva y permita que los saltahojas se alimenten de ellas durante dos días. Después de dos días, retire los saltahojas de sus jaulas de alimentación y recoja las plántulas de arroz de las que se alimentaban los saltahojas. Cortar las plántulas fuera de la jaula y recuperar las regiones de alimentación de las plántulas.
Prepare 1x tampón de Tris-Glicina diluyendo 200 mililitros del tampón 5x preparado con 800 mililitros de agua estéril. Luego prepare el tampón 10x TBS y autoclave la solución a 121 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, prepare el tampón de muestra de proteína 4x.
Luego prepare el tampón de transferencia mezclando 800 mililitros del tampón Tris-Glycine con 200 mililitros de metanol. Finalmente, prepare la solución TBST agregando 100 mililitros de 10x TBS y tres mililitros de Tween 20 a 900 mililitros de agua estéril. Para detectar las proteínas salivales y virales, muele 0,1 gramos de las muestras de arroz con nitrógeno líquido hasta que el tejido se convierta en polvo.
Luego agregue 200 microlitros del tampón de muestra de proteína 4x a la muestra y hierva durante 10 minutos. Centrifugar las muestras y transferir el sobrenadante a un nuevo vial. Cargue 10 microlitros de la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecútela en tampón Tris-Glycine a 150 voltios durante 45 a 60 minutos.
Mientras el gel está funcionando, coloque una membrana de nitrocelulosa de 0,45 micras y otros suministros de sándwich en el tampón de transferencia durante 30 minutos. Después de la ejecución, emparede el gel y transfiéralo durante 90 a 120 minutos a 100 voltios en el búfer de transferencia. Después de completar la secación, coloque la membrana en una solución de bloqueo de leche en polvo sin grasa al 7% en TBST e incube durante 20 minutos.
Después de eso, agregue un anticuerpo contra el virus enano del arroz P8 o vitelogenina e incube la membrana durante dos horas o durante la noche. Después de la incubación, lave la membrana con TBST tres veces con una incubación de cinco minutos entre cada lavado. Luego agregue IgG anti-conejo de cabra como anticuerpo secundario e incube la membrana durante 60 a 90 minutos.
Utilice el kit ECL Western para la detección quimioluminiscente en reactivos de detección mixtos uno y dos en el kit en una proporción de uno a uno. Coloque la membrana sobre el reactivo mezclado e incube la seca durante cinco minutos. Drene el exceso de reactivo y tome una imagen quimioluminiscente y colorimétrica de la membrana.
Combine las imágenes para ver este último con bandas de proteínas. El análisis de Western blot para la detección de vitelogenina mostró bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kilodaltons en la alimentación de plantas de arroz y glándulas salivales de los insectos. En contraste, no se observó banda en las plantas que no se alimentaban, lo que indica que la vitelogenina se liberó en el huésped de la planta como una proteína salival.
El análisis de Western blot para la detección de la proteína P8 del virus enano del arroz mostró una banda específica y esperada de aproximadamente 46 kilodaltons en plantas de alimentación y cuerpos de insectos viruliferos. En contraste, no se observó ninguna banda en plantas no alimentadas y cuerpos de saltahojas no viruliferos, lo que demuestra que las proteínas virales también podrían detectarse en las plantas de alimentación. La carga viral en los saltahojas, el momento de detección y las réplicas deben tenerse en cuenta al realizar este protocolo.
Este método también se puede aplicar para estudiar mosquitos que transmiten arbovirus.
