Este protocolo se puede utilizar para estudiar diversos movimientos en insectos, funciones de proteínas de insectos e interacciones entre virus e insectos vectores in vivo. Este método es eficiente e informativo. Las estructuras del intestino del insecto y las células auxiliares se visualizan claramente cuando se observan con la microscopía confocal de barrido láser.
Demostrando el procedimiento estará Lu Zhang, PhD de nuestro laboratorio. Para comenzar, transfiera insectos no virulíferos de vasos de vidrio al virus enano fresco del sur con rayas negras, SRBSDV, plantas de arroz infectadas cubiertas con una red a prueba de insectos durante un período de acceso a la adquisición del virus de dos días. Luego recoja los insectos en vasos de vidrio que contienen plántulas de arroz fresco.
Después de dos días, recoja los insectos de los vasos de vidrio usando un aspirador manual para la disección y escisión del intestino. Prepare 0.01 PBS molar, 4% paraformaldehído y 2% Triton X-100 como se describe en el texto manuscrito. Use un pipeter para colocar 100 microlitros de PBS en un portaobjetos de vidrio y coloque el portaobjetos en el escenario de un microscopio óptico.
Use un aspirador manual para recoger a los adultos infectados con SRBSDV de los vasos de vidrio y colóquelos en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo para paralizar a los insectos. Transfiera a un adulto paralizado a los 100 microlitros de PBS en el portaobjetos con el abdomen hacia arriba. Use pinzas para sujetar el cuerpo y retire la cabeza con otro juego de pinzas.
Con un juego de pinzas, sujete los lados del abdomen y sujete el ovipositor o el órgano copulatorio de la cola con el otro conjunto, luego tire con cuidado de la membrana intersegmentaria de un segmento abdominal para exponer lentamente el intestino en el abdomen. Continúe arrancando la membrana y gradualmente saque el intestino completo del abdomen. Tire suavemente de la cola que está conectada al extremo del intestino para eliminar el intestino completo.
Coloque las tripas extirpadas en un tubo de centrífuga de 200 microlitros. Agregue 200 microlitros de PBS al tubo y use una pipeta para lavar bien las tripas. Use un pipeter para colocar 100 microlitros de PBS en un portaobjetos de vidrio y coloque el portaobjetos en el escenario de un microscopio óptico.
Use un aspirador manual para recolectar las ninfas infectadas con SRBSDV de vasos de vidrio y colóquelas en un tubo de 1.5 mililitros colocado en hielo para paralizar a los insectos. Transfiera una ninfa paralizada a los 100 microlitros de tampón en el portaobjetos con el abdomen hacia arriba. Separa la cola de la ninfa, luego sujeta el cuerpo del insecto para fijarlo suavemente y usa el otro par para sujetar la cabeza.
Tire suavemente de la cabeza lejos del cuerpo mientras mantiene su unión al intestino para que la cabeza se separe del cuerpo, pero el intestino todavía está unido al tórax y al abdomen. Con las pinzas todavía sujetando el cuerpo, use el otro par para mover la cabeza con cuidado y sacar gradualmente el intestino. Separe el intestino de la cabeza para obtener un intestino intacto sin dañar el cuerpo.
Coloque las tripas extirpadas en un tubo. Agregue PBS al tubo y succione suavemente la solución con una pipeta para lavar bien las tripas. Preparar los anticuerpos y el medio de montaje como se describe en el texto manuscrito.
Coloque las tripas WBPH recién extirpadas y lavadas con PBS en 100 microlitros de paraformaldehído al 4% en un tubo centrífugo de 200 microlitros a temperatura ambiente. Después de dos horas, reemplace la solución de paraformaldehído con 200 microlitros de PBS. Después de 10 minutos, retire el PBS para eliminar cualquier paraformaldehído y repita el paso de lavado de PBS dos veces.
Después de dos lavados PBS, agregue 200 microlitros de detergente no iónico Triton X-100 para permeabilizar las muestras a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire el Triton X-100 y lave cualquier detergente restante con tres lavados de 10 minutos con PBS. Diluir los anticuerpos marcados de uno a 50 con 50 microlitros de albúmina sérica de toro.
Agregue los anticuerpos diluidos al tubo e incube las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. En la mañana después de retirar el anticuerpo, lave el diluyente de anticuerpos restante con tres lavados de 10 minutos con PBS. Diluir un microlitro de DyLight 633-Phalloidin con 50 microlitros de PBS y añadir 50 microlitros de faloidina diluida al tubo para una incubación de dos horas a temperatura ambiente.
Después de eliminar la faloidina, lave bien la faloidina restante con tres lavados de 10 minutos con PBS. Coloque una gota de medio de montaje que contenga DAPI en un portaobjetos de microscopio. Transfiera las tripas al medio y coloque suavemente el vidrio de cubierta sobre la muestra sin crear burbujas.
La micrografía confocal representativa de escaneo láser de intestinos extirpados de WBPH de adultos después del etiquetado con faloidina mostró tres secciones: intestino anterior, intestino medio e intestino posterior. Entre estos, el intestino medio es el sitio de infección inicial de SRBSDV. La estructura celular epitelial monocapa del intestino facilita el estudio de la localización celular de proteínas de insectos y la colocalización de proteínas virales e insectos.
Aquí se muestran las tripas WBPH extirpadas con viriones anti-VAMP-7 marcados con DyLight 488 y viriones SRBSDV con anticuerpos anti-SRBSDV marcados con DyLight 549. Se demostró que los viriones VAMP-7 y SRBSDV se colocalizan en el citoplasma, lo que sugiere que VAMP-7 puede desempeñar un papel en la transmisión del virus in vivo. Los intestinos permeabilizados deben limpiarse a fondo después de la incubación con anticuerpos conjugados con luciferina para reducir el fondo y la unión no específica.
Este es un método confiable para ver la localización de virus, otros patógenos y proteínas de insectos en insectos. Proporciona la base para estudios adicionales de la relación entre patógenos e insectos.
