Este método puede ayudar a producir grandes cantidades de ARN recombinantes de interés para su aplicación en la investigación o la industria. La principal ventaja es que el ARN recombinante se produce en Escherichia coli en un proceso barato que se puede escalar fácilmente. Es importante destacar que el ARN se produce en un andamio circular de ARN, lo que facilita la purificación a la homogeneidad.
A diferencia del ADN o las proteínas, los ARN de interés no se producen fácilmente en grandes cantidades en sistemas biofactores, como un cultivo de Escherichia coli. Nuestro método se basa en la coexpresión del ARN de interés insertado en un andamio circular altamente estable y aplicando un ligasel que media la circularización del ARN. El andamio circular de ARN deriva de un viroide patentado.
Los viroides son relativamente pequeños, no enrollados, ARN circulares altamente emparejados con base que son infecciosos para algunas plantas más altas. Podemos producir decenas de miligramos del ARN recombinante por litro de cultivo bacteriano en condiciones regulares de laboratorio. Para comenzar este procedimiento, amplíe el ADNc por PCR como se describe en el protocolo de texto.
A continuación, agregue 100 nanogramos del plásmido pLELVd-BZB a un tubo de 0,5 mililitros. Agregue 10 U del tipo de enzima de restricción DE IIS BpiI y suficiente búfer G para crear una reacción de 20 microlitrotros. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora para digerir el plásmido.
Después de esto, separar los productos de PCR y digestión por electroforesis en un gel de agarosa del uno por ciento en tampón TAE. Manchar el gel agitando en 200 mililitros de bromuro de etidio a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro. Usando un transiluminador UV, visualice el ADN.
Utilice un bisturí para cortar las bandas correspondientes al ADNv amplificado y al plásmido digerido BpiI. Usando columnas de gel de sílice, ele los DNA de los fragmentos de gel. Cuantificar la concentración del ADN mediante análisis espectrofotométrico.
Configure una reacción de Gibson Assembly utilizando el ADNv amplificado y el plásmido digerido. Incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Luego, usa una columna de gel de sílice para purificar la reacción.
Después de electroporar células competentes de E.coli DH5-Alpha, recoger varias colonias blancas y transferirlas a medio LB líquido. Cultivar las colonias durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, utilice un kit de miniprep para purificar los plásmidos, y analice sus tamaños por electroforesis en un gel de agarosa del uno por ciento en tampón TAE.
En primer lugar, co-electroporar la cepa E.coli seleccionada con el derivado pLELVd-BZB que contiene el ADNc correspondiente al ARN de interés y el plásmido P15LTRNISM para co-expresar la berenjena tRNA ligase. Transfiera el medio líquido SOC a la cubeta de electroporación para recuperar las células, e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, placar las bacterias en medio sólido LB que contiene 50 microgramos por mililitro ampicilina, y 34 microgramos por mililitrolitrol.
Incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, añadir 250 mililitros de medio líquido de TB, que contiene 50 microgramos por mililitro ampicilina, y 34 microgramos por mililitrolitor cloranfenicol, a un matraz Erlenmeyer desconcertado de un litro. Recuperar el E. coli incubado, y luego elegir una colonia e inocular el medio en el matraz.
Incubar a 37 grados centígrados con agitación vigorosa a 180 RPM durante 12 a 16 horas antes de cosechar la bacteria. Vierta el cultivo de E. coli cosechado en una botella centrífuga de 250 mililitros y gire las células a 14.000 G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 30 mililitros de agua.
Transfiera esta suspensión a un tubo centrífugo y vuelva a girar las células utilizando las condiciones anteriores. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de tampón de cromatografía al pellet celular. Vórtice para resuspender las celdas en el búfer.
Añadir un volumen de fenol: cloroformo y vórtice vigorosamente para romper las células. Luego, centrifugar a las 12.000 G durante 10 minutos. Recuperar la fase acuosa, añadir un volumen de cloroformo, y vórtice vigorosamente.
Centrifugar a 12.000 G durante 10 minutos. Después de esto, filtre la preparación del ARN a través de un filtro de jeringa de 45 micrómetros. Purifique el ARN utilizando una columna de amina de etanol dietilétil de un mililitro conectada a un sistema de cromatografía líquida.
Ajuste el caudal a un mililitro por minuto y equilibre la columna con 10 mililitros de tampón de cromatografía. A continuación, cargue la muestra y lave la columna con 10 mililitros de tampón de cromatografía. Eluir el ARN con 20 mililitros de tampón de elución, y recoger un mililitro alícuotas.
Usando electroforesis de gel de poliacrilamida bidimensional, separe los ARN circulares de sus contrapartes lineales. En primer lugar, preparar un gel de poliacrilamida del cinco por ciento en tampón TBE y que contenga ocho urea molares como se describe en el protocolo de texto. Mezclar 20 microlitros de las preparaciones de ARN con un volumen de búfer de carga.
Incubar a 95 grados centígrados en un bloque de calentamiento durante 1,5 minutos, y luego enfriar sobre hielo. Cargue las muestras en el gel de poliacrilamida y ejecute la electroforesis en las condiciones adecuadas para la dimensión del gel. Después de esto, manche el gel en 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio durante 15 minutos.
Lave el gel manchado con agua y luego visualice el ARN bajo la luz UV. El análisis electroforético de varios plásmidos recombinantes en los que se insertan diferentes cDNAs muestran diferentes migraciones en comparación con pLELVd-BZB. Tenga en cuenta que pLELVd-BZB contiene el marcador lacZ, que es reemplazado por el ADNc correspondiente al ARN de interés, por lo que si bien la migración depende del tamaño del ADNr insertado, los plásmidos recombinantes generalmente migrarán más rápido que el plásmido de control.
La producción del ARN recombinante en cultivos bacterianos co-electroporados se controla rompiendo las células y analizando el ARN desnaturalizado. Se pueden ver bandas fuertes, que corresponden a formas vacías de ELVd y ELVd quiméricos, en las que se insertaron diferentes ARN de interés. Curiosamente, una fracción importante del ARN recombinante se ve como una forma circular.
La circularidad de la fracción principal se observa mediante el uso de una combinación de dos PAGEs en condiciones de desnaturalamiento a alta y baja resistencia iónica. La preparación del ARN se puede purificar aún más mediante cromatografía de intercambio de aniones. Como se ve aquí, el ARN de E. coli se retiene eficientemente a baja resistencia iónica, y posteriormente se elue a alta resistencia iónica, con la mayor parte del ARN se recoge en fracciones dos y tres.
El ARN recombinante se puede purificar aún más a la homogeneidad mediante la electroforesis 2-D. Este protocolo permite la fácil producción de grandes cantidades de ARN recombinante en Escherichia coli y purificación a homogeneidad gracias a la circularidad del producto final. Recuerde que el ARN de interés resulta incrustado en un andamio de ARN circular derivado de un viroide de la planta.
Si desea separar ambas mitades, debe utilizar una estrategia estándar, como ribozimas, DNAzymes o RNase H.El rendimiento de este protocolo depende del ARN particular de interés, ya que es probable que los ARN pequeños se produzcan en cantidades más altas que las más grandes. Para expresiones a mayor escala, tenga en cuenta que el tiempo óptimo para cosechar bacterias depende de muchos factores, incluyendo la cepa E. coli, medio de cultivo y condiciones de cultivo. Recomendamos un ensayo preliminar de curso de tiempo para encontrar la ventana de producción óptima en sus condiciones particulares.
Recuerde que los ARN recombinantes se acumulan en las células bacterianas de forma transitoria, y que desaparecen por completo en la fase de crecimiento tardío.
