En este procedimiento, mostramos cómo proceder de un polvo de molécula pequeña a una estructura tridimensional en minutos. Esta es una técnica transformadora para la comunidad química. Muchos compuestos no crecen fácilmente en cristales grandes.
Con MicroED, podemos determinar estructuras de resolución atómica a partir de cristales de tamaño nanométrico. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Mike Martynowycz, profesor de UCLA. Para comenzar, transfiera una pequeña cantidad de polvo, líquido o sólidos a un pequeño vial o tubo.
Para muestras que ya están en forma de polvo, selle el tubo con la tapa hasta que se necesite la muestra. Del mismo modo, seque las muestras líquidas en polvos. Envuelva la película de plástico alrededor de un extremo de un portaobjetos de cubierta de vidrio.
Coloque las rejillas TEM en la película en la parte superior de la diapositiva de la cubierta con el lado de carbono de color marrón hacia arriba. Luego, coloque la diapositiva con rejillas en la cámara de descarga incandescente y descargue la corredera de cubierta durante aproximadamente 30 segundos utilizando el ajuste negativo a 15 picoamperios. Guarde las rejillas en el portaobjetos de la cubierta dentro de una placa de Petri de vidrio forrada con papel de filtro antes de agregar la muestra a las rejillas.
Retire la rejilla TEM de descarga luminosa de la placa de Petri cubierta con pinzas y colóquela sobre un papel de filtro circular con el lado de carbono hacia arriba. Con una espátula pequeña, retire una cucharada muy pequeña de polvo y colóquela en un pequeño cubreobjetos de vidrio cuadrado justo al lado de la rejilla TEM en el papel de filtro. Coloque otro pequeño portaobjetos cuadrados de vidrio o un deslizamiento de cubierta encima del polvo.
Con los dedos, frotó suavemente los dos portaobjetos de vidrio para hacer un polvo fino. Incline los cubreobjetos y colóquelos justo encima de la rejilla TEM en el papel de filtro y continúe frotando los cubreobjetos de cubierta unos pocos centímetros por encima de la rejilla TEM descargada con brillo. Observe si el polvo está cayendo hacia la rejilla.
Destape el polvo finamente molido quitando uno de los dos trozos de cubierta de vidrio. Luego, cepille suavemente el polvo fino del deslizamiento de la cubierta sobre la rejilla TEM con un trozo de papel de filtro. Agarre el borde de la cuadrícula TEM con un conjunto de pinzas, asegurándose de que las puntas no perforen ninguno de los cuadrados de la cuadrícula.
Levante la rejilla de uno a dos centímetros por encima del papel de filtro e incline la rejilla a 90 grados con respecto al papel de abajo. Golpee suavemente las pinzas mientras mantiene la rejilla firmemente pinzada para eliminar cualquier polvo suelto. Congele la rejilla moviendo la punta de las pinzas con la rejilla directamente a un recipiente de nitrógeno líquido a mano y espere hasta que la rejilla y las pinzas dejen de hervir.
Bajo nitrógeno líquido, coloque la rejilla en el portamuestras con el lado de carbono orientado de tal manera que la muestra sea golpeada por el haz antes de la película de soporte de carbono. Cargue el portamuestras en el TEM asegurándose de que la rejilla siempre se mantenga a temperaturas de nitrógeno líquido. Para los sistemas de cargador automático, coloque las rejillas recortadas en un casete en un recipiente refrigerado por nitrógeno líquido, lo que permite que la robótica del cargador automático acepte el casete mientras mantiene las muestras seguras para el transporte entre el cargador automático y la columna.
Abra las válvulas de columna TEM y ajuste el aumento con los paneles manuales al menor aumento posible. Encuentra el haz ajustando la perilla de intensidad en los paneles de mano de modo que un área redonda brillante sea visible en la pantalla fluorescente. Tome un atlas de cuadrícula a baja ampliación utilizando el software adecuado para garantizar que el microscopio esté bien alineado para imágenes de bajo y alto aumento antes de recopilar datos MicroED de alta resolución.
Identifique cuadrados de cuadrícula sin carbono roto y granos negros u oscuros visibles en la película. Navegue por la cuadrícula ya sea físicamente usando el joystick en los paneles de mano o virtualmente en el atlas recopilado para buscar cuadrados de cuadrícula que no estén rotos y contengan microcristales. Agregue el centro de cada uno de estos cuadrados a una lista de ubicaciones de cuadrícula para investigación, que se puede agregar a un cuaderno en la interfaz de usuario del microscopio o en el software de automatización del microscopio.
Ajuste el aumento entre 500 y 1300x. Ajuste la altura céntrica en cada ubicación de cuadrícula almacenada y actualice el valor z guardado a las posiciones anotadas. Busque en la pantalla fluorescente o en una cámara plana pequeños puntos negros o granos en la cuadrícula.
Una buena muestra a menudo tendrá bordes afilados a gran aumento, lo que sugiere un cristal en orden. Mueva un cristal potencial localizado al centro de la pantalla y aumente el aumento de tal manera que el TEM entre en modo de aumento alto. Inserte una abertura de área seleccionada y cambie la apertura a un tamaño mayor o menor para asegurarse de que el área seleccionada sea más grande que el cristal.
Cambie al modo de desfracción presionando el botón de desfracción en los paneles manuales TEM para asegurarse de que se inserte la pantalla fluorescente. Ajuste la longitud de la cámara con la perilla de ampliación de modo que el borde tenga al menos una resolución angstrom. Ajuste el enfoque de difracción de modo que el punto central sea lo más nítido y pequeño posible.
Usando las perillas de desplazamiento de difracción, mueva el haz central hacia el centro de la pantalla fluorescente. Inserte el tope de viga asegurándose de que la viga esté detrás de ella. Levante la pantalla fluorescente y tome una exposición corta en la cámara.
Inspeccione el patrón de desfracción correspondiente, asegurándose de que el patrón tenga puntos afilados que estén dispuestos regularmente en columnas y filas. Guarde las coordenadas cristalinas en la interfaz de usuario de TEM o escribiéndolas, luego repita la detección de difracción para todos los cristales potenciales de interés en el cuadrado de cuadrícula actual. Centra el cristal apantallado con un aumento superior a 1000x y ajusta la altura central del cristal usando una rutina automática o a mano.
Inserte la abertura de área seleccionada que mejor se adapte al tamaño y la forma del cristal. Incline el escenario en las direcciones negativa y positiva hasta que la imagen esté ocluida por las barras de cuadrícula. Y tenga en cuenta estos ángulos para fines de recopilación de datos leyendo los datos cada segundo en una cámara moderna con un modo de lectura de obturador enrollable.
Establezca la velocidad de rotación especificando el porcentaje de la velocidad de inclinación máxima y cuándo detenerse en la interfaz de usuario del microscopio o en el software dedicado. Guardar los datos en una variedad de formatos dice marcos individuales o como una pila de imágenes. Una película de desfracción en formato cristalográfico recolectada de microcristales muestra un conjunto de datos MicroED de rotación continua a partir de un microcristal de carbamazepina identificado en una cuadrícula TEM.
Después de la recopilación de datos, la integración y la solución de estructura, se determina una estructura de alta resolución y su claridad depende de la calidad e integridad de los datos. La aplicación de la muestra a la cuadrícula es fundamental para adquirir buenos datos. Siguiendo este método, los datos se pueden procesar aún más utilizando un software cristalográfico estándar.
Demostrar que MicroED es un método poderoso para moléculas pequeñas ha abierto su uso en todo el mundo para resolver nuevas estructuras de moléculas de importancia crítica.
