La señalización de redox desregulada está implicada en la patogénesis de diversas enfermedades. El estudio de la biología redox requiere la detección precisa de especies reactivas de oxígeno en diferentes compartimentos celulares y tisulares. La espectroscopia EPR es el único método que mide los radicales libres de forma inequívoca.
Este protocolo demuestra un método práctico para la manipulación y almacenamiento de muestras biológicas para espectroscopia EPR. Estos protocolos ilustran el uso de sondas EPR y spin en dos modelos representativos. Aunque se pueden adaptar para evaluar las especies activas en otros entornos biológicos.
El diseño del experimento y el manejo de la muestra son críticos para su reproducibilidad. Recomendamos considerar la densidad de celdas y garantizar controles adecuados que coincidan con el tiempo. Comience lavando suavemente 264,7 células crudas con un mililitro de Krebs-Henseleit Buffer o KHB, por pozo.
Y tratar las células con 500 microlitros de KHB, complementados con 100 micromil de DTPA por pozo. Para pretratar con superóxido dismutasa, agregue 15 microlitros de material de superóxido dismutasa, o vehículo, a cada pozo, y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Al final del pretratamiento de superóxido dismutasa, añadir 12,5 microlitros de 10 CMH mililolares y 40 microlitros de 125 micromolares PMA solución de trabajo a los pozos adecuados, e incubar a 37 grados Celsius durante 50 minutos.
Coloque inmediatamente las placas sobre hielo y recoja el tampón de cada pozo en tubos individuales de 1,5 mililitros sobre hielo. A continuación, agregue 100 microlitros de KHB fresco más DTPA a cada pozo y raspe suavemente las células de la parte inferior de cada pozo. Luego resuspendir las suspensiones celulares con pipeteo y transferir las células a tubos individuales de 1,5 mililitros sobre hielo.
Para la detección de superóxido a temperatura ambiente, primero cargue 50 microlitros de un tampón o muestra de célula en un tubo capilar y selle el tubo. Coloque inmediatamente el tubo en la resonancia paramagnética de electrones, o EPR, espectrómetro y establezca los parámetros de adquisición de EPR para las mediciones de temperatura ambiente. Pruebe siempre una muestra en blanco de búfer que contenga la misma concentración de sonda tratada en las mismas condiciones experimentales que un control.
Para la detección de superóxido a 77 grados Kelvin, cargue 150 microlitros de una muestra en una pieza de una a dos pulgadas de politetrafluoroetileno recto, o PTFE, tubo, con un tapón de goma en un extremo. Selle el otro extremo del tubo con un segundo tapón y congele la muestra en nitrógeno líquido. A continuación, retire rápidamente los tapones y coloque el tubo de PTFE en un criotubo etiquetado para el almacenamiento de nitrógeno líquido.
Para las mediciones de EPR, llene la dewar del dewar del espectrómetro EPR con nitrógeno líquido y coloque el tubo de PTFE que contiene la muestra en el nitrógeno líquido. Coloque la dewar del dedo en el espectrómetro EPR y establezca los parámetros de adquisición de EPR para las mediciones en 77 grados Kelvin. Para la detección de ROS en el tejido pulmonar congelado, coloque el tejido sobre hielo seco y use pinzas para estabilizar el tejido congelado por el flash en hielo seco.
Cortar la muestra en cinco trozos de 15 miligramos, y pesar las piezas en un tubo de tarado de 1,5 mililitros. Añadir 196 microlitros de KHB más DTPA y cuatro microlitros de CMH a la muestra, e incubar la muestra pulmonar durante una hora en un baño de agua de 37 grados Celsius antes de peletizar los fragmentos de tejido con una breve centrifugación. A continuación, coloque la muestra sobre hielo antes de transferir 150 microlitros del sobrenadante en un pedazo de tubo de PTFE para la congelación de flash en la preparación de la medición de EPR como se acaba de demostrar.
La evaluación de la producción total de superóxido en células crudas 264,7 estimuladas con PMA como se ha demostrado, revela que la concentración de nitroxida tanto en la suspensión celular como en el tampón de las células tratadas con PMA es similar, debido a la naturaleza permeable y al rápido equilibrio de la sonda de espín. La señal de los radicales de nitroxida aumenta en células crudas 264,7 estimuladas con PMA, en comparación con las células de control, pero no en células pretratadas con superóxido impermeable celular dismutasa. La concentración de nitroxida obtenida a bajas temperaturas en células crudas 264,7 después de la estimulación con PMA también se atenúa en presencia de superóxido dismutasa consistente con los datos de temperatura ambiente.
La concentración de nitroxida aumenta en la sangre y el líquido de lavado broncoalveolar de ratones bleo y ratones tratados, así como dentro de los sobrenadantes de piezas de tejido pulmonar cosechadas de ratones bleo y animales heridos, en comparación con los controles tratados con PBS. Además, después de la inyección retro-orbital de la sonda de espín, los ratones bleo y los animales tratados demuestran una señal de sonda de espín más alta en comparación con los controles. Estos protocolos prácticos permitirán a los investigadores probar la producción de radicales libres en diferentes compartimentos celulares y muestras biológicas por EPR, incluidas las mediciones de baja temperatura.
