Las mitocondrias dependen en gran medida del genoma nuclear, a pesar de tener su propio ADN. Por lo tanto, se requiere un mecanismo de importación altamente regulado. Este método ayuda a estudiar el proceso y cómo puede adaptarse a los estímulos externos.
Esta es la única técnica bioquímica disponible para evaluar cuantitativamente la importación de proteínas en los diversos subcompartimentos de las mitocondrias. La viabilidad de las mitocondrias está implicada en varios estados de enfermedad, por lo que comprender cómo se regula la importación de proteínas puede ayudar a contribuir a nuevos enfoques terapéuticos que se dirigen a las mitocondrias. Se requiere un cuidado adicional durante el aislamiento para garantizar la viabilidad e integridad de las mitocondrias.
Es necesario picar a fondo el tejido y resuspender suavemente todos los gránulos posteriores. Demostrando el procedimiento estará Ashley Oliveira, una estudiante de doctorado en mi laboratorio. Para comenzar el aislamiento de las mitocondrias del músculo esquelético, elimine la grasa y el tejido conectivo de los músculos y exprima los tejidos en un vidrio de reloj preenfriado hasta que sea una suspensión homogénea.
Coloque el tejido picado en un tubo de centrifugación de plástico de 50 mililitros preenfriado y registre el peso exacto. Luego, diluya el tejido picado diez veces con tampón 1 que contenga ATP. Use un homogeneizador de doble hoja de ocho milímetros para homogeneizar la muestra muscular a una potencia de salida de 9.8 Hertz durante 10 segundos, asegurando que no queden trozos visibles de músculo.
Después de girar la muestra a 9, 000x G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, vuelva a suspender el pellet cuidadosamente en aproximadamente 95 microlitros del medio de resuspensión. Centrifugar la muestra antes de desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet suavemente con aproximadamente 180 microlitros de medio de resuspensión utilizando una pipeta P-200. Para la traducción in vitro, prepare suficiente mezcla de reacción de traducción para suministrar 20 microlitros por muestra de mitocondrias que se utilizarán en experimentos de importación y para un carril de traducción.
Coloque la reacción para la incubación a 30 grados centígrados durante 30 minutos. 15 minutos después del inicio de la reacción de traducción, alícuota 90 microgramos de mitocondrias en tubos estériles de 1,5 mililitros y preincuba a 30 grados centígrados durante 10 minutos. En un nuevo conjunto de tubos estériles de 1,5 mililitros, combine 75 microgramos de mitocondrias con 18 microlitros de la reacción de traducción e incube el tubo a 30 grados centígrados durante el tiempo deseado.
Mantenga el volumen restante de la reacción de traducción en hielo. Para terminar la reacción de importación después del tiempo de incubación apropiado, retire el tubo de 30 grados Celsius para colocarlo en hielo y luego transfiera cuidadosamente la reacción de importación en la parte superior del tubo con el cojín de sacarosa. Centrifugar las muestras con cojín de sacarosa a 17.000x G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Usando una pipeta P-1000, retire cuidadosamente el sobrenadante sin molestar el pellet. Para importar a la membrana externa, realice la reacción utilizando Tom40 y resuspenda el pellet en 50 microlitros de carbonato de sodio 0.1 molar recién preparado e incube en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, centrífuga la muestra a 14, 000x G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, prepare las muestras para la electroforesis SDS-PAGE como se describe en el manuscrito. Prepare el carril de traslación de control mezclando tres microlitros de la reacción de traslación restante con 37 microlitros de tampón de lisis y cinco microlitros de tinte de muestra. Hervir las muestras durante cinco minutos a 95 grados centígrados y girar suavemente hacia abajo a baja velocidad para evitar la peletización de las mitocondrias.
Después de aplicar muestras al gel de poliacrilamida SDS, hierva el gel en ácido tricloroacético al 5%, o TCA, en una campana de humos durante cinco minutos con agitación continua. Luego, coloque el gel en agua doble destilada en una placa giratoria durante un minuto a 50 rotaciones por minuto. Lave el gel en Tris 10 milimolares en una placa giratoria durante cinco minutos a 50 rotaciones por minuto.
Para precipitar la proteína, lave el gel en un volumen suficiente de ácido salicítico un molar para cubrir el gel en una placa giratoria durante 30 minutos. Para deshidratar el gel, coloque una hoja grande de papel secante en la cama porosa del secador de gel y una hoja de una toalla de papel en el área donde se aplicará el gel. Luego, corte 11 centímetros por 9 centímetros de papel secante y coloque el papel sobre la toalla de papel.
Use una segunda pieza de papel secante de 11 centímetros por 9 centímetros para sacar el gel del recipiente y coloque el gel plano sobre la primera pieza. Coloque una pieza de plástico un poco más grande sobre el gel, asegurándose de que no haya pliegues o burbujas debajo de la envoltura. Luego, coloque la cubierta de plástico del secador de gel sobre la parte superior de la envoltura.
Encienda la aspiradora. Asegúrese de que la cubierta de plástico haya formado un sello levantando la esquina de la cubierta de plástico y esperando a que la cubierta se vuelva a sellar. Cierre el secador de gel para que funcione durante 90 minutos, comenzando a 30 grados centígrados para alcanzar los 80 grados centígrados gradualmente, y vuelva a 30 grados centígrados al final de la carrera.
Envuelva el gel en la envoltura de plástico utilizada en el proceso de secado. Una vez deshidratado, el gel se solidificará y se sentirá delgado como el papel. Coloque el gel deshidratado en un cassette con una película de fósforo en la parte superior.
Exponga la película durante 24 horas antes de visualizar el gel mediante autorradiografía con cualquier generador de imágenes adecuado que sea capaz de obtener imágenes de fósforo. El análisis representativo muestra las tasas normales de importación de malato deshidrogenasa, o MDH, en las mitocondrias subsarcolémmicas e intermiofibrilares, y el producto de traducción del precursor MDH. La adición de valinomicina inhibió la importación de proteínas MDH en la matriz de las mitocondrias SS y IMF.
Del mismo modo, el detergente Tritón X inhibió la importación de MDH en ambas subfracciones debido a la solubilización de la membrana interna. La estimación de la importación de proteínas se llevó a cabo para duraciones de tiempo crecientes, y los datos consiguientes ilustraron que la importación es un proceso dependiente del tiempo, y las mitocondrias SS y IMF tienen diferentes tasas o capacidades de importación. Cuando las ratas fueron sometidas a estimulación eléctrica, la importación de Tom 40 en la membrana externa fue mayor en el músculo de animales estimulados crónicamente en comparación con los controles.
La ornitina transcarbamilasa, o importación de OCT, en la matriz mitocondrial se incrementó en cada punto temporal de incubación, lo que resultó en un aumento de 1,4 veces en las mitocondrias del músculo estimulado crónicamente. La importación de proteínas se correlacionó positivamente con un índice de contenido mitocondrial y se evaluó mediante la actividad de la COX. Al investigar la apoptosis mediada por mitocondrias, los animales de doble knockout de Bax y Bak exhibieron una importación reducida de proteínas en la matriz mitocondrial.
Seis semanas de funcionamiento voluntario de la rueda rescataron el defecto de importación en animales de doble knockout. Es importante considerar variables como la duración de la reacción de importación y qué proteína se va a importar. Las fracciones citosólicas se pueden incorporar a la reacción para comprender cómo los factores citosólicos pueden influir en la tasa de importación.
Alternativamente, las proteínas pueden modificarse antes de la incubación para comprender cómo las proteínas pueden importarse selectivamente. Esta técnica puede ayudar a comprender las etiologías complejas de las miopatías mitocondriales que pueden presentarse en varios estados de enfermedad.
