Para mejorar la comprensión de la unión factor-ADN de transcripción, desarrollamos un método para medir constantes de disociación a gran escala utilizando, por ejemplo, mediciones de anisotropía. Esta técnica permite obtener automáticamente curvas de valoración completas para determinar la constante de disociación con alta sensibilidad. Funciona en solución en equilibrio, tiene un rendimiento moderado y un amplio rango dinámico.
Aplicamos HiP-FA para refinar el panorama de afinidad de unión de los factores de transcripción. Sin embargo, el protocolo podría aplicarse a otros tipos de eventos de unión como las interacciones proteína-proteína o proteína-fármaco, por ejemplo. Aconsejo realizar primero múltiples valoraciones con los mismos socios de unión para obtener una estimación sobre la reproducibilidad de las mediciones.
Si está disponible, utilice un sistema automatizado para una mayor reducibilidad. Para recocido los oligómeros de ADN del ADN de referencia, mezcle siete microlitros de cada cadena inversa di-etiquetada milimétrica y sin etiquetar en un tubo. Para el ADN de la competencia, mezcle 20 microlitros de cada hebra sin etiquetar de 100 milimolares en dos pozos de una placa PCR de 96 pozos.
A continuación, utilice una máquina de PCR estándar para calentar las soluciones de ADN a 70 grados Celsius durante los tres minutos. Luego, reduzca a temperatura ambiente a una velocidad de 0,1 grados Centígrados por segundo. Utilice un horno microondas para fundir 0,5 gramos de agarosa en un tampón de unión de 100 mililitros.
Añadir agua destilada doble para ajustar el volumen final para compensar la posible evaporación. Preparar alícuotas de diez mililitros. Para preparar los pozos de valoración y calibración de una placa de 96 pozos, transfiera dos alícuotas de stock de gel a una coctelera incubadora de 75 grados Celsius.
Para cada pozo de valoración, agregue 1,4 nanomoles de ADN de referencia, proteína de factor de transcripción, a una concentración final de 20-60 nanomoles, 0,2 milivarios de TDT y el tampón de unión a 240 microlitros del gel fundido. Mezcle bien invirtiendo y agitando el tubo. A continuación, pipetee lentamente 200 microlitros por pozo del gel que contiene ADN en los pozos de valoración designados de una placa de 96 pozos.
Para cada pozo de calibración, añada 5 nanomoles de colorante azul del nilo a 240 microlitros del gel fundido. Evitando las burbujas de aire, pipetee lentamente 200 microlitros de la solución de gel que contiene tinte en cinco a seis pozos de la placa de 96 pozos. Coloque el gel sobre una superficie perfectamente horizontal e incubar durante diez minutos a temperatura ambiente, y otros 10 minutos a 4 grados centígrados.
Utilice un lector de placas de varios pozos para comprobar la homogeneidad de los niveles de altura del gel en diferentes pozos de la placa. Para preparar la solución de ADN de la competencia, primero combine el ADN de referencia etiquetado, la proteína y el tampón de unión concentrado triple. A continuación, mezcle 20 microlitros de la solución con 40 microlitros de cada una de las soluciones de ADN de la competencia recocido.
Para cada pozo de calibración, combine las cantidades adecuadas de una de las soluciones de ADN de la competencia recocido y el tampón de unión concentrado triple que contiene 15 soluciones de colorante azul del nilo milimétrico. Por último, añada 50 microlitros de las soluciones mixtas de la competencia en la parte superior de los geles de la forma más simultánea posible. Para comenzar la adquisición de imágenes, coloque la placa de 96 pozos en la etapa del microscopio.
Luego, tome series temporales de imágenes de pozos de pila Z hasta desvincular completamente la proteína del ADN de referencia. Realice el ensayo de valoración de acuerdo con el manuscrito. A continuación, utilice el software HiP-FA para crear curvas de valoración para secuencias individuales de la competencia.
A continuación, haga clic en el botón de exportación para obtener la constante de disociación y la concentración de la proteína activa en cada pozo de valoración. Tenga especial cuidado al pipetear las soluciones de gel que son viscosas. El pipeteo inexacto puede reducir la precisión para la determinación de las constantes de disociación.
En este estudio, se aplica el método HiP-FA para determinar las preferencias de unión al ADN de un factor de transcripción B-zipped. Gigante, de la red genética de segmentación de moscas. La alta similitud de los PWM para las réplicas que se prepararon manualmente o utilizando técnicas de automatización demostró la alta reproducibilidad del método HiP-FA.
PWM obtenidos por este método y otros métodos son en general similares. Sin embargo, se pueden observar desviaciones significativas en las posiciones dos y siete del motivo central donde las mutaciones pueden conducir a una pérdida completa de unión, o una unión mucho más fuerte que las mediciones anteriores. Utilizamos HiP-FA para generar refinamientos para las fijaciones de decenas de factor de transcripción y muestra que obtiene al final una mejor predicción de datos.
Creemos que su medida de alta precisión puede ser muy útil para entender mejor la unión TF-DNA para todo el sistema o para todo tipo de interacciones.
