La persecución por pulsos radiactivos utilizando 35 metionina y cisteína con etiqueta S sigue siendo los únicos métodos bioquímicos para investigar la biosíntesis de proteínas con el tiempo en células vivas. La biosíntesis de proteínas abarca tanto la traducción, el plegado y el montaje, como el tráfico y la degradación. La combinación de la persecución por pulsos radiactivos con el análisis de las modificaciones de las proteínas co-y post-traducción, como la formación de unión de disulfuro y la acetilación proporciona un ensayo sensible y cuantitativo para investigar la fe de la proteína con el tiempo.
Para este procedimiento se requiere un buen enfoque y manejo experimental. Una buena preparación es crucial, como los tampones, su espacio de trabajo radiactivo y un horario claro. Este video proporciona una visión clara sobre el hombro del protocolo de persecución de pulsos radiactivos.
Demostrando el procedimiento estará Hui Ying Yeoh, un candidato pHd de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, las celdas de referencia de inicialización y de referencia cultural se describen en el protocolo de texto. Antes de la persecución por pulsos, inspeccione sus células a través del microscopio.
A continuación, lave los platos con dos mililitros de tampón de lavado. Y dos mililitros de inanición medio a las células y colocar los platos en una incubadora humidificada a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Asegúrate de que la configuración de tu persecución de pulsos esté en orden.
Transfiera los platos a los estantes en el baño de agua, precalegado a 37 grados centígrados. Asegúrese de que los platos estén en contacto con el agua, pero no flote. Entonces, inicia un temporizador.
A los 40 segundos, aspira el medio de inanición. Con una micro pipeta, extraiga 600 microlitros de solución de pulso. En exactamente un minuto, agregue suavemente la solución de pulso al centro del plato.
Repita este proceso de eliminación del medio de inanición y adición de la solución de pulso para los platos restantes a intervalos de un minuto. A exactamente 11 minutos y para todos los platos siguientes, de acuerdo con el esquema de persecución de pulsos, a excepción de la muestra de persecución de minuto cero, añadir dos mililitros de medio de persecución directamente al plato. Aspirar el medio de persecución y reemplazarlo con dos mililitros de nuevo medio de persecución.
Repita este proceso para todos los platos restantes a intervalos de un minuto. Cuando el temporizador lea exactamente 16 minutos, agregue dos militers de medio de persecución directamente a la antena de persecución de cero minutos, en la parte superior del medio de pulso, para dejar de etiquetar. Inmediatamente aspirar el medio.
Transfiera el plato a una placa de aluminio enfriada y agregue dos militers de tampón de parada fría. Transfiera todos los demás platos a una incubadora a 37 grados centígrados. Transfiera cada plato de persecución de vuelta de la incubadora al baño de agua dos minutos antes del final de cada tiempo de persecución.
En el momento exacto de persecución para cada plato, aspirar el medio de persecución y transferir el plato a una placa de aluminio enfriado. Agregue dos mililitros de tampón de parada fría. Deje todos los platos sobre hielo y detenga el tampón hasta que haya tiempo para enteblar las células.
A continuación, aspirar la solución de parada y lavar todos los platos. Tres al mismo tiempo con dos mililitros de solución de parada de frío helado. Aspirar completamente la solución de parada y añadir 600 microlitros de tampón de lelisis a dos platos a la vez.
Usando un rascador de células, raspe bien la superficie del plato, pero suavemente para mezclar el licate. Transfiera el licato de cada plato a un tubo de micro centrífuga fresco de 1,5 mililitros. Centrifugar a 15.000 a 20.000 G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar los núcleos.
Para la persecución por pulsos en las células de suspensión recoger cinco millones de células por punto de tiempo en un tubo de 50 mililitros. Realice el procedimiento de inanición como se describe en el texto. Después del procedimiento de inanición en el baño de agua durante 15 minutos, encienda el temporizador.
En exactamente un minuto, agregue 275 microcuries de etiqueta sin diluir directamente al tubo que contiene las células y gire para mezclar. En exactamente 11 minutos, agregue cuatro mililitros de medios de persecución para detener el etiquetado. Y transfiera inmediatamente un mililitro a un tubo de 15 mililitros en hielo que contenga nueve mililitros de solución de parada fría para dejar de etiquetar.
Repita este proceso de transferir un mililitro de persecución a un tubo sobre hielo que contenga nueve mililitros de solución de parada para cada punto de tiempo de persecución sucesiva. Después de la inmunoprecipitación, aspirar el último lavado por completo. Vuelva a suspender las perlas en 20 microlitros de tampón TE y vórtice.
Agregue 20 microlitros de dos Tampón de muestra X sin el agente reductor. Vórtice las muestras y luego calientelas a 95 grados Centígrados durante cinco minutos. Vórtice las muestras de nuevo.
Centrifugar a 12.000 veces G a temperatura ambiente durante un minuto. Transfiera 19 microlitros del sobrenadante no reducido a un tubo de microcentrífuga fresco que contenga un microlitro de 500 DDT militrolar. Si es necesario, centrifuga la muestra rápidamente para que todos los líquidos estén en la parte inferior.
Y calienta a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Deje que la muestra reducida se enfríe y luego vórtice. Centrifugar las muestras reducidas y no reducidas a 12.000 veces G a temperatura ambiente durante un minuto, y luego añadir 1,1 microlitros de un NEM molar a todas las muestras.
En este estudio, se utiliza un enfoque de persecución de pulsos radiactivos para analizar el plegado de proteínas y el transporte en células intactas. Aquí se muestra el plegado y la secreción del VIH un GP120 de una persecución por pulsos adherente. El gel no reductor muestra el plegado oxidativo de GP120.
Inmediatamente después del etiquetado del pulso, aparece como una banda difusa más alta en el gel. A medida que la persecución avanza, la banda migra hacia abajo el gel a través de intermedios plegables aún más difusos hasta que se acumula en la banda apretada que representa plegada de forma nativa en GP120. Esto ocurre a medida que la formación de enlaces de disulfuro aumenta la compacidad de la proteína, haciendo que migre más rápido que la proteína totalmente reducida.
En el gel reductor, los enlaces de disulfuro y todas las moléculas se han reducido y no afectan a la mobiilty. Como tal, las diferencias en la movilidad son sólo el resultado de cambios en la masa molecular. El cambio con el tiempo de la forma cambiada del péptido de señal reducida a la forma reducida de péptido de señal cortado representa la escisión del péptido de señal post-traduccional de GP120.
La movilidad aumenta debido a la pérdida del péptido de señal que aumenta durante la persecución a medida que más proteínas alcanzan el pliegue nativo y pierden su péptido de señal. Tanto en el gel no reductor y reductor, la señal comienza a disminuir a partir de aproximadamente una hora debido a la secreción de GP120. Esto se puede supervisar mediante el análisis de los medios.
Este método es aplicable a cualquier línea celular, incluidos los modelos de células organoides. Pero el éxito depende en gran medida del nivel de expresión de la proteína de interés. Antes de comenzar este procedimiento, marque sus platos y mantenga este orden durante todo el experimento.
Asegúrese de que todo está preparado antes de agregar un medio de hambre. Este es el comienzo del experimento. Y tu tiempo de laboratorio es tu amigo, pero puede ser tu mayor enemigo cuando no estés preparado.
La persecución de Bill se puede combinar con proteólisis limitada para investigar el patrimonio completo de proteínas con el tiempo. También diferentes métodos de congeladores elegidos permitirán el análisis de enjuague o rigormorización o diferencias de carga. Para proteger al investigador y al aparato, deben obedecerse todas las normas locales de seguridad de la radiación.
Y las medidas de protección deben tomarse de acuerdo con el protocolo. Tenga en cuenta que su acrilamida, utilizada para su página STH es neurotóxica.
