Este misterio puede ayudar a responder algunas preguntas en el campo de la biología celular, como la entrada de proteínas en los cloroplastos. La principal ventaja de esta tecnología es que la entrada de proteínas en los cloroplastos se puede estudiar en condiciones en vivo. Demostrando el procedimiento serán Junho Lee y Hyangju Kang, dos post outs de mi laboratorio.
Para comenzar, cosecha los tejidos de las hojas intactas de plantas de dos semanas de edad de una a dos placas B5. Utilice un cuchillo quirúrgico para cosechar las hojas y colóquelas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución enzimática. Coloque el tubo horizontalmente sobre una coctelera giratoria e incubar con agitación suave a 22 grados centígrados en la oscuridad durante ocho a 12 horas hasta que sólo los pecíolos y tallos permanezcan en la solución.
Después de completar la incubación, filtre la solución enzimática que contiene protoplastos liberados a través de una malla de 140 micrómetros de tamaño de poro en un plato fresco de Petri. A continuación, coloque cuidadosamente la solución encima de 15 mililitros de 21% de solución de sacarosa en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo en un rotor de cucharón oscilante a 98 gs durante 10 minutos con la menor configuración de aceleración y desaceleración.
Después de eso, utilice la pipeta de patura para eliminar cuidadosamente los protoplastos de la capa superior que contiene la solución enzimática y de la interfaz entre la solución de enzimas y la solución de sacarosa. Transfiera esta solución a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de solución W5 e invierta el tubo para mezclar. Centrifugar el tubo a 51 gs durante seis minutos.
Utilice una pipeta para desechar este sobrenadante cuidadosamente sin alterar los protoplastos en el pellet. Añadir 25 mililitros de solución W5 y volver a suspender suavemente los protoplastos. Para la estabilización, incubar en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante un mínimo de una hora.
Después de cuatro grados de incubación Celsius, peletiza los protoplastos completamente centrifugándolos a 46 gs durante dos minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante por completo y agregue la solución MANG al pellet de protoplasto para lograr cinco veces diez a seis por mililitro. Utilice una pipeta para añadir 10 microgramos del ADN plasmático y 300 microlitros de solución de protoplasto a un tubo fresco de fondo redondo de 13 mililitros.
Mezclar girando suavemente los tubos a mano y luego añadir inmediatamente 300 microlitros de solución 40%PEG recién preparada. Mezclar completamente inclinando el tubo casi horizontalmente y girándolo suave varias veces a mano. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, agregue un mililitro de solución W5 y mezcle completamente girando suavemente el tubo a mano como anteriormente. Incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita dos veces más con la adición de primero 1,5 mililitros y luego dos mililitros de W5 y después de la adición final y la mezcla, incubar durante 30 minutos.
Centrifugar el tubo a 46 gs durante cuatro minutos y luego desechar el sobrenadante. Añadir dos mililitros de solución W5 al pellet y mezclar suavemente, pero completamente, de la misma manera que anteriormente. Incubar a 22 grados centígrados en una cámara oscura durante 18 horas.
Para analizar la importación de proteínas mediante microscopía de florescencia, utilice una pipeta con una punta recortada para colocar 10 microlitros de la solución de protoplasto en un portaobjetos. Utilice un resbalón de cubierta para cubrir cuidadosamente la solución para evitar dañar los protoplastos. Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio de fluorescencia con un filtro de admisión de excitación que esté configurado para observar la proteína fluorescente verde y la autofluorescencia de clorofila.
Utilice una cámara de dispositivo de par de carga enfriada para capturar imágenes y procesarlas utilizando un software de edición imagine para producir imágenes pseudocolor. Para la extracción total de proteínas y la inmunoblotting, retire un mililitro de la solución de protoplasto y mezcle el mililitro restante. Transfiera esta solución de protoplasto a un tubo centrífugo y centrífuga a 46 gs durante cuatro minutos.
Retire el sobrenadante después de completar la centrifugación y agregue 80 microlitros de tampón de desnaturalización. Vórtice vigorosamente durante cinco segundos. Agregue cinco tampón de muestra XDS, mezcle bien y hierva durante 10 minutos hasta la desnaturaltura.
Continúe con la página estándar de STS y el inmunoblotting con anticuerpos anti-GFP. RbcS y TGFT, una construcción de fusión que codifica los residuos de aminoácidos terminales de 79 extremos de RBCS que contienen el péptido de tránsito fusionado a la GFP, se utilizó para estudiar la importación de proteínas en cloroplastos mediante microscopía de florescencia e inmunoblotting. Cuando se examinan mediante microscopía de florescencia, las señales fluorescentes verdes de la proteína diana se fusionaron con las señales fluorescentes rojas de la autoflorescencia de clorofila que indica la importación de proteínas en cloroplastos.
Después de aislar la proteína total, se observan dos bandas de proteínas en el inmunoblot, mostrando que una proteína se importó correctamente en cloroplastos. La banda superior corresponde al precursor de longitud completa y la banda inferior a la forma procesada después de la importación en cloroplastos. La cantidad de la forma procesada de la proteína aumentó de una manera dependiente del tiempo, lo que sugiere que la proteína se importa en cloroplastos.
En este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran el cansaning de proteínas o la recolección de hilos de membrana en Arabidopsis.
