이 정교한 비침습적 도구를 사용하여 마우스의 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 이는 유방암 치료 및 질병 관리에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 진행 및 질병 관리에 대한 전임상 연구를 진행하는 데 유용한 전략입니다. 이것은 항암제 연구에 적용될 수 있습니다.
이 프로토콜은 유방암에만 국한되지 않으며 폐 및 췌장과 같은 다른 암종에도 적용될 수 있습니다. MCF-7, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-231 GFP 및 루시페라아제 양성 세포를 16센티미터 플레이트에서 개별적으로 80% 컨플루언시로 성장시킴으로써 시작한다. 트립신화에 의해 세포를 수확한 후, 각 웰에 점점 더 많은 수의 세포를 검정색 96-웰 플레이트에 시드한다.
그런 다음 모든 웰을 100 마이크로리터의 DMEM으로 채우고 섭씨 37도, 5 % CO2 인큐베이터에서 16 ~ 24 시간 동안 배양하십시오. PBS 중의 루시페린 용액을 밀리리터 당 1.5 밀리그램의 농도로 준비하고, 용액을 영하 20도에서 보관하십시오. 인큐베이션 후, 각 웰에 루시페린 용액 100 마이크로리터를 첨가하기 전에 PBS로 세포를 한 번 부드럽게 세척한다.
두 분 동안 기다린 다음, 생체발광을 이용하여 모든 유방암 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 마우스를 주입하기 전에, 5백만 MCF-7 및 MDA-MB-468 세포를 PBS 200 마이크로리터 및 2백만 MDA-MB-231 GFP 및 루시페라아제 양성 세포로 100 마이크로리터 PBS로 옮긴다. 마취된 마우스를 수핀 위치에서 머리 위에 원뿔을 올려 주사할 준비를 한다.
다음으로, 면봉을 이용하여 에탄올로 유선위 마우스의 복부 부위를 닦아내고, 네 번째 유선의 포셉을 들어 올린 후 지방 패드 아래에 27게이지 바늘을 삽입하여 준비된 세포 현탁액 100 마이크로리터를 천천히 주입한다. 주사 후, 마우스를 후드에서 꺼내어 의식으로 돌아갈 때까지 관찰중인 새로운 케이지로 옮깁니다. 생체 발광 검출 전에 왼손으로 목을 잡고 손을 왼쪽으로 기울여 의식이있는 마우스를 제지하여 마우스의 얼굴을 위쪽으로 향하게하고 하체가 수핀 위치에 있습니다.
1 밀리리터 주사기를 사용하여 마우스의 왼쪽 아래 복부 사분면에 복강내 30 밀리리터 루시페린 100 마이크로 리터를 주입하십시오. 마우스를 마취 없이 일곱 분 동안 유지하고, 종양 동역학을 측정하기 전에 마취실 내에서 삼분 동안 유지하였다. 마우스가 인큐베이션 상태일 때 소프트웨어를 열고 초기화 버튼을 클릭하여 이미징 시스템을 초기화합니다.
자동 노출 시간을 60초로 자동 노출하고, 매체를 f/stop 조리개에서 비닝하고, 여기 필터가 차단되고, 방출 필터가 열린 상태로 자동 노출에 대한 설정을 유지합니다. 초기화가 끝나면 이미징 마법사 및 생체 발광을 선택하고 다음, 필터 열기를 클릭하여 이미지 피사체에서 마우스를 선택합니다. 필드 뷰에서 스테이지 C를 10센티미터에서 선택하고 피사체 높이를 1.50센티미터로 선택합니다.
그런 다음 이미지 설정 단계를 C로 클릭합니다.문을 닫고 획득 버튼을 클릭하기 전에 마우스가 적절한 수핀 위치에 스테이지에 배치되었는지 확인하십시오. 이미지가 화면에 나타날 때까지 기다립니다. 다른 마우스에 대해 이 절차를 반복합니다.
폐 전이를 감지하려면 두꺼운 판지 종이를 사용하여 원발성 종양의 강한 신호를 덮고 폐의 복부 측면 만 카메라 쪽으로 노출시킵니다. 앞에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 유방암 세포주를 형광 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시키고 FAC 분류를 실시하였다.
GFP 양성 세포를 감염 이틀 후에 분류하고, 도금하고, 형광 현미경으로 시각화하였다. 시험관내 루시퍼라제 활성은 세포수 의존적인 루시퍼라제 활성 수준의 증가와 함께 확인되었다. 또한, 루시퍼라제 활성과 세포 수 사이에 선형 상관관계가 발견되었다.
유방암 세포주를 주입한 후, 마우스에 종양 성장 동역학을 확인하기 위해 두 주마다 생체발광 판독을 실시하였다. 종양 성장 동역학은 덜 공격적인 세포주, MCF-7 및 MDA-MB-468에서보다 MDA-MB-231 세포주에서 더 빨랐다. 발광 활성을 세 개의 세포주에 대해 정량화하였다.
주사 육주 후, 수확된 종양은 GFP 발현을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 양성 생체발광 판독값은 전체 마우스의 폐로부터 실시간으로 얻어졌다. 양성 전이성 콜로니를 확인하기 위해 폐를 수확하고, GFP 및 생체발광에 대해 전이성 콜로니를 관찰하였다.
주사 절차를 수행하는 동안주의하는 것이 더 중요합니다. 부적절한 주사는 종양 성장 속도의 편차 또는 종양의 부재로 이어질 수 있습니다. 우리는 GFP 발현을 검출함으로써 생체내 및 생체외에서 폐 전이를 검사할 수 있다.
또한, 우리는 또한 면역 조직 화학 기반 염색에 의해 폐의 조직 병리학을 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 약물 효능 연구의 효과와 같은 새로운 질문을 탐구하는 데 유용 할 수 있습니다.
