Используя этот сложный, неинвазивный инструмент, мы можем в режиме реального времени контролировать кинетику роста опухоли и метастатическую колонизацию у мышей, что имеет большой потенциал в терапии рака молочной железы и лечении заболеваний. Сочетание люциферазы и обнаружения флуоресценции является полезной стратегией для продвижения доклинических исследований прогрессирования рака молочной железы и лечения заболеваний. Это может быть применено для исследований противоопухолевых препаратов.
Этот протокол не ограничивается раком молочной железы и может применяться к другим карциномам, таким как легкие и поджелудочная железа. Начните с выращивания MCF-7, MDA-MB-468 и MDA-MB-231 GFP и люцифераз-положительных клеток отдельно в 16-сантиметровой пластине до 80% конфлюентности. После сбора клеток путем трипсинизации посейте все большее количество клеток в каждой лунке в черную 96-луночную пластину.
Затем заполните все колодцы 100 микролитрами DMEM и инкубируйте в течение 16-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия, 5% CO2 инкубатора. Готовят раствор люциферина в PBS в концентрации 1,5 миллиграмма на миллилитр и хранят раствор при минус 20 градусах Цельсия. После инкубации тщательно промыть клетки PBS, прежде чем добавлять 100 микролитров раствора люциферина в каждую лунку.
Подождите две минуты, а затем измерьте активность люциферазы во всех клетках рака молочной железы с помощью биолюминесценции. Перед инъекцией мыши переместите пять миллионов клеток MCF-7 и MDA-MB-468 в 200 микролитров PBS и два миллиона MDA-MB-231 GFP и люцифераз-положительных клеток в 100 микролитров PBS. Подготовьте обезболенную мышь к инъекции, поместив конус над головой в лежачее положение.
Затем протрите брюшную область мыши над молочной железой этанолом, используя ватный тампон, и поднимите четвертую молочную железу щипцами, прежде чем вставить иглу 27-го калибра под жировую прокладку, чтобы медленно ввести 100 микролитров подготовленной клеточной суспензии. После инъекции выньте мышь из капюшона и перенесите ее в новую клетку под наблюдением, пока она не вернется в сознание. Перед обнаружением биолюминесценции удерживайте сознательную мышь, держа ее шею левой рукой и наклоняя руку влево, в результате чего лицо мыши поднимается вверх, а нижняя часть тела находится в положении лежа.
Введите 100 микролитров 30 миллиграммов на миллилитр люциферина внутрибрюшинно в нижний левый брюшной квадрант мыши с помощью одномиллилитрового шприца. Держите мышь в течение семи минут без анестезии, а затем три минуты в анестезиологической камере, прежде чем измерять кинетику опухоли. Пока мышь находится в инкубации, откройте программное обеспечение и инициализируйте систему обработки изображений, нажав кнопку Инициализировать.
Держите настройку в автоматическом экспонировании с временем экспозиции в авто в 60 секунд, биннингом среды на диафрагме f/stop one, фильтр возбуждения заблокирован и эмиссионный фильтр открыт. После завершения инициализации выберите Мастер создания образов и Биолюминесценция, а затем нажмите кнопку Далее, Открыть фильтр, чтобы выбрать мышь в объекте изображения. В поле зрения выберите стадию C на 10 сантиметров и высоту объекта на 1,50 сантиметра.
Затем щелкните Стадия настройки образа, чтобы C.Убедитесь, что мышь помещена на рабочую область в правильном положении лежа, прежде чем закрыть дверь и нажать кнопку Получить. Дождитесь появления изображения на экране. Повторите процедуру для другой мыши.
Чтобы обнаружить метастазы в легкие, накройте сильный сигнал первичной опухоли с помощью плотной картонной бумаги и обнажите только вентральную сторону легких по направлению к камере. Захватите изображение, используя те же параметры, что и описанные ранее. Клеточные линии рака молочной железы были инфицированы лентивирусным вектором, экспрессирующим флуоресцентный GFP и подлежащим сортировке FAC.
GFP-положительные клетки были отсортированы через два дня после заражения, покрыты и визуализированы флуоресцентным микроскопом. Активность люциферазы in vitro была подтверждена клеточным числозависимым увеличением уровня активности люциферазы. Кроме того, была обнаружена линейная корреляция между активностью люциферазы и номером клетки.
После инъекции клеточных линий рака молочной железы мышей подвергали показаниям биолюминесценции каждые две недели, чтобы определить кинетику роста опухоли. Кинетика роста опухоли была быстрее в клеточных линиях MDA-MB-231, чем в менее агрессивных клеточных линиях, MCF-7 и MDA-MB-468. Люминесцентная активность была количественно определена для трех клеточных линий.
Через шесть недель после инъекции было обнаружено, что собранные опухоли поддерживают экспрессию GFP. Кроме того, положительные показания биолюминесценции были получены из легкого всей мыши в режиме реального времени. Легкое было собрано для проверки положительных метастатических колоний, а метастатические колонии наблюдались для GFP и биолюминесценции.
Важнее быть осторожным при выполнении процедуры инъекции. Неправильная инъекция может привести к отклонению скорости роста опухоли или отсутствию опухоли. Мы можем исследовать метастазы в легкие in vivo и ex vivo, обнаруживая экспрессию GFP.
Кроме того, мы также можем изучать гистопатологию легких путем окрашивания на основе иммуногистохимии. Этот метод может быть полезен для изучения новых вопросов, таких как влияние исследований эффективности лекарств.
