El ensayo basado en microscopía para estudiar y analizar los endosomas de reciclaje utilizando el tráfico de SNARE. Estos son melanocitos de la piel. Los orgánulos de color negro que se ven dentro de las células se llaman melanosomas.
Los melanosomas se conocen como una clase de orgánulos llamados orgánulos relacionados con el lisozoma o LRO. Los endosomas de reciclaje son orgánulos vesiculares tubulares de endosomas tempranos o clasificatorios en todos los tipos de células. Estos orgánulos juegan un papel clave en la biogénesis de los melanosomas, un orgánulo relacionado con el lisozoma producido por los melanocitos.
Los endosomas de reciclaje entregan la carga específica de melanocitos a los melanosomas prematuros durante su formación. la generación de endosomas de reciclaje observada en varios síndromes es células en hiperpigmentación de la piel, el cabello y los ojos. Por lo tanto, estudiar la dinámica del reciclaje de endosomas es útil para comprender la función de estos orgánulos en condiciones normales y de enfermedad.
Este estudio tiene como objetivo medir la dinámica de reciclaje de endosomas utilizando la sintaxis SNARE-13 de detención. El primer paso es la siembra de melanocitos de ratón en fundas pretratadas. Cubra las cubiertas de vidrio en placa de Petri en medio de matriz de membrana basal.
Y sécalo en la campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos. Lave las fundas una vez con 1X PBS antes de usar. Sembrar las células en la membrana basal media recubiertas de cubiertas a 50 a 60% de competencia.
Siempre agregue 200 nanomolares de PMA a la suspensión celular chapada en medios RPMI completos. Después de sembrar las células, incube el plato que contiene células en la incubadora de CO2 durante 12 a 24 horas. El segundo paso es la transfección de células con plásmidos de sintaxina-13.
Incubar las puntas que contienen ADN y reactivo de transfección, mezclar durante cinco minutos y mezclar sin pipetear repetidamente. Golpee el tubo con la mano cada diez minutos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, lave las células dos veces con 1X PBS, una vez con OPTI-MEM, y luego agregue 1 mil de OPTI-MEM a las células.
Después de 30 minutos de incubación, agregue la mezcla de ADN del reactivo de transfección a las células de una manera superficial cubriendo el plato. Incubar las células a 37 grados centígrados durante seis horas. Aspire el medio OPTI-MEM con reactivo de transfección y agregue medio RPMI completo complementado con 200 nanomolares de PMA.
Incubar las células a 37 grados centígrados durante 48 horas. El tercer paso es la fijación de las células. Tenga en cuenta que el siguiente procedimiento se realiza fuera de la campana de cultivo de tejidos.
Después de 48 horas de transfección, lave las células dos veces con 1X PBS y luego fije las células con 3% de formaldehído durante 30 minutos. Después de la fijación, lave las celdas dos veces con 1X PBS y guarde las fundas en 1X PBS hasta su uso posterior. Alternativamente, las células pueden montarse en placas de vidrio o almacenarse a cuatro grados centígrados.
El cuarto paso es la inmunotinción de las células. Prepare una cámara húmeda. Coloque la pieza cortada con parafilm en un papel de filtro de ratón en una placa de Petri.
Cubrir con papel de aluminio. Preparar 25 microlitros de solución primaria de anticuerpos. Agregue anticuerpos a una dilución de uno a 200.
Agregue esta solución como una gota en la parapelícula en la cámara húmeda. Levante con cuidado la cubierta con fórceps. Invierta en la gota de solución de tinción de anticuerpos primarios y luego cubra la tapa de la cámara húmeda.
Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Del mismo modo, prepare la solución secundaria de anticuerpos en una dilución de uno a 500 y colóquela en la parapelícula junto a la cubierta en la cámara húmeda. Para teñir el núcleo, agregue DAPI a una dilución de 120, 000 a 130, 000 a la solución.
Usando fórceps, recoja cuidadosamente el cubrebocas de la solución de anticuerpos primarios y sumérjalo dos veces en 1X PBS. Toque el trozo de cubierta en papel de seda para eliminar el exceso de PBS en el lape de cubierta. Colóquelo en la solución secundaria de tinción de anticuerpos en la cámara húmeda y no lo exponga a la luz, debido a la presencia de anticuerpos teñidos fluorescentemente en la solución.
Después de la incubación, recoja cuidadosamente el cubrehojas de la solución secundaria de anticuerpos y luego sumérjalo dos veces en 1X PBS. Además, toque el trozo de cubierta en papel de seda para eliminar el exceso de PBS en el lape de cubierta. Coloque 12 microlitros de reactivo de imágenes en un portaobjetos de vidrio y coloque cuidadosamente la cubierta manchada en el reactivo de montaje.
Invierta el portaobjetos de vidrio sobre el papel de seda y luego presione suavemente. A continuación, tome imágenes de la cubierta con un microscopio de fluorescencia y analice las imágenes con ImageJ. El sexto paso es la cuantificación de la superposición entre las proteínas localizadas del endosoma de reciclaje y los melanosomas.
Cuantificación de la colocalización de la sintaxina-13 delta-129 con los melanosomas. La microscopía de inmunofluorescencia de la sintaxina-13 en melanocitos de tipo salvaje de ratón mostró GFP-sintaxina-13 de tipo salvaje localizado como estructuras vesiculares y tubulares. Y GFP-sintaxina-13 delta-129 localiza estructuras en forma de anillo además de la superficie celular.
Además, GFP-syntaxin-13 delta-129 en forma de anillo intracelular mostró colocalización con la proteína melanosoma TYRP1 en melanosomas con imágenes de campo brillante. Como se mostró anteriormente, se observa una cohorte de tipo salvaje GFP-sintaxina-13 sobreexpresada en melanosomas. Para medir la localización relativa de GFP-syntaxin-13 wild type y GFP-syntaxin-13 delta-129 a melanosomas, se utilizó el software Fiji y se realizó el análisis con el complemento JACOP.
El coeficiente de superposición de Mander medido, es decir, MOC, entre GFP-sintaxina-13 delta-129 con TYRP1 es aproximadamente 1,5 veces mayor en comparación con el tipo salvaje GFP-sintaxina-13 con TYRP1. Curiosamente, TYRP1 mostró valores de MOC 2,9 veces más altos con GFP-sintaxina-13 delta-129 en comparación con GFP-sintaxina-13 tipo salvaje. Estos datos indican que la localización de los melanosomas GFP-sintaxina-13 delta-129 es relativamente mayor en comparación con el tipo salvaje GFP-sintaxina-13 en un estado estacionario.
Cuantificación de la localización de tipo salvaje de sintaxina-13 de los endosomas de reciclaje. La microscopía de inmunofluorescencia de tipo salvaje GFP-sintaxina-13 mostró colocalización con la conocida proteína endosomal de reciclaje Rab11. El MOC entre GFP-syntaxin-13 wild type con mCherry-Rab11 es aproximadamente 1.4 veces mayor en comparación con mCherry-Rab11 con GFP-syntaxin-13 wild type.
Para medir el número y la longitud de los túbulos endosomales positivos de tipo salvaje GFP-sintaxina-13, se utilizó el software de Fiji como se describe en la sección de protocolo. mCherry-Rab11 se utiliza como control positivo en los experimentos. Los melanocitos transfectados con GFP-sintaxina-13 de tipo salvaje mostraron un mayor número de túbulos por célula en comparación con las células que expresan mCherry-Rab11.
Sin embargo, los túbulos se reducen tras la coexpresión tanto de GFP-sintaxina-13 tipo salvaje como de mCherry-Rab11 en las células. El séptimo paso es la cuantificación del número y la longitud tubular de los endosomas de reciclaje. Los túbulos se reducen al coexpresarse tanto de tipo salvaje GFP-sintaxina-13 como de mCherry-Rab11 en las células.
Curiosamente, la longitud promedio del túbulo tanto del tipo salvaje GFP-sintaxina-13 como de mCherry-Rab11 es comparable entre sí en células que se expresan individualmente o juntas. Juntos, estos datos sugieren que el tipo salvaje GFP-sintaxina-13 se localiza en el reciclaje de endosomas como similar a Rab11. Este estudio mostró que la entrega N-terminal del mutante de sintaxina-13, es decir, GFP-sintaxina-13 delta-129, se localiza en melanosomas GFP-sintaxina-13 delta-129 posiblemente se puede utilizar como un reportero para el tráfico vesicular desde el reciclaje de endosomas a la superficie celular y LRO.
En contraste, el tipo salvaje GFP-sintaxina-13 se localiza en el reciclaje de endosomas como similar a Rab11. Este estudio ilustró que el tipo salvaje GFP-sintaxina-13 también podría usarse para marcar endosomas de reciclaje en melanocitos. El tipo salvaje de sintaxina-13 GFP puede ser un mejor marcador endosomal de reciclaje que Rab11, ya que Rab11 altera la dinámica endosómica.
En conjunto, el tipo salvaje GFP-sintaxina-13 actúa como un marcador endosomal de reciclaje potencial para estudiar la dinámica en condiciones de estado estacionario.
