Esta investigación fue financiada por fondos nacionales y europeos a través de la Fundación Portuguesa de Ciencia y Tecnología (FCT), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y el Programa Operacional Factores de Competitividad (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) y POCI-01-0145-FEDER-007440. Los autores desean agradecer el apoyo de iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, una instalación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Coimbra y miembro de la infraestructura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de Bioimagen (POCI-01-0145-FEDER-022122), así como el apoyo de FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Instituto Coimbra de Investigación Clínica y Biomédica (iCBR) Organismo de Bienestar Animal (ORBEA, # 9 / 2018) y cumplieron con las Directivas Nacionales y Europeas de Cuidado de Animales y con las directrices ARRIVE.
1. Diseño experimental
<ol><li>Parejas de ratas Wistar macho de 13 semanas de edad en jaulas ventiladas en condiciones ambientales controladas de temperatura (22 °C ± 1 °C), humedad (50%-60%) y luz (ciclo luz-oscuridad de 12 h) y con acceso ad libitum al agua del grifo y comida estándar para roedores.</li>
	<li>Después de un período de aclimatación de 2 semanas, asigne arbitrariamente a las ratas en dos grupos.</li>
	<li>Alimente a los grupos de control (CTRL, n = 6) y dieta alta en grasas (HFD, n = 6) con comida estándar y una dieta alta en grasas (45% kcal / grasa), respectivamente, durante 24 semanas.</li>
	<li>Controle el peso corporal (PC) semanalmente. Registre el consumo diario de alimentos y bebidas por jaula.</li>
</ol>2. Preparación de la muestra de hígado
<ol><li>Disección hepática<ol><li>Prepare la bomba peristáltica: Pase etanol al 70% a través del tubo, conecte una aguja de 27 G al extremo de salida del tubo y prepare el tubo con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH ~ 7.4) (por ejemplo, 200 rpm en una bomba peristáltica con tubo de silicio I.D. de 1.6 mm, mini juego de goteo IV). Ajuste el peso corporal (por ejemplo, para una rata de 100-150 g, use un caudal de aproximadamente 10-12 ml / min).</li>
		<li>Anestesiar a la rata mediante una inyección intraperitoneal utilizando un protocolo de anestesia (la concentración final de ketamina = 75 mg / kg y la concentración final de medetomidina = 1 mg / kg). NOTA: Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada usando el método de respuesta de pellizco del dedo del pie.</li>
		<li>Coloque la rata en la bandeja de disección.</li>
		<li>Desinfecte bien el pelaje con etanol al 70% y séquelo con una toalla de papel.</li>
		<li>Con unas tijeras, haga una incisión en forma de "U" a través de la piel y córtela por debajo del diafragma. Luego, corte la caja torácica rostralmente en los bordes para exponer el corazón.</li>
		<li>Mientras el PBS 1x está funcionando, pase la aguja a través del ventrículo izquierdo hasta la aorta ascendente y la pinza. Luego, se corta la aurícula derecha para permitir el drenaje una vez que la perfusión ha comenzado. NOTA: El hígado debe comenzar a blanquearse a medida que la sangre se reemplaza con PBS.</li>
		<li>Usando tijeras y pinzas Dumont, retire el hígado con cuidado y enjuague con 1x PBS.</li>
		<li>Transfiera el hígado a una placa de Petri y péselo.</li>
		<li>Usando un bisturí, recolecte muestras de tejido hepático de 5 mm de espesor desde el lado lateral (1 cm del borde) del lóbulo izquierdo del hígado para el proceso de incrustación. NOTA El tejido restante se puede almacenar a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incrustación de tejido hepático<ol><li>Prepare un recipiente de hielo seco y etiquete adecuadamente los criomoldes con la identificación y orientación de la muestra.</li>
		<li>Coloque unas gotas de matriz de incrustación criogénica en el centro del criomold para obtener la temperatura de corte óptima (OCT).</li>
		<li>Asegúrese de que la muestra de tejido esté orientada correctamente para una sección transversal. NOTA: Asegúrese de que el lado que toca la parte inferior del criomold sea el lado que se seccionará primero.</li>
		<li>Deje caer con cuidado más OCT sobre el criomold hasta que esté completamente cubierto. Trate de evitar la formación de burbujas de aire. Si es necesario, con pinzas simples, retire cualquier burbuja dentro de la OCT.</li>
		<li>Coloque rápidamente el criomold con la muestra cubierta de OCT en un recipiente de hielo seco. NOTA: Los tejidos pueden almacenarse a −80 °C durante 3 años.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sección de tejido congelado
<ol><li>Ajuste la temperatura del criostato (cámara: -21 °C; muestra: -18 °C) e inserte una nueva cuchilla estéril.</li>
	<li>Coloque las muestras en el criostato durante 30 minutos antes de permitir que la temperatura se equilibre.</li>
	<li>Haga una sola capa de OCT en el disco de la muestra para permitir la adhesión de la muestra. Deje que la OCT se congele y monte la muestra de tejido en la orientación deseada. NOTA: La superficie de corte debe ser paralela a la cuchilla. Para mantener una buena adherencia, coloque el extractor de calor en la parte superior de la muestra. Los pasos anteriores también se pueden realizar en un recipiente de hielo seco con hielo seco.</li>
	<li>Coloque la muestra en la cabeza de la muestra y recorte la superficie del tejido (algunas secciones de muestra de tejido de 30 μm).</li>
	<li>Una vez que la región de interés sea accesible para la sección, corte secciones de 12 μm de espesor y colóquelas en portaobjetos de microscopio etiquetados que se mantengan a temperatura ambiente (RT). NOTA: Para recoger la sección, mueva lentamente el portaobjetos hacia la sección de tejido. Cada diapositiva puede recoger dos secciones del hígado.</li>
	<li>Deje que los portaobjetos se sequen durante 10 minutos en RT. NOTA: Los portaobjetos se pueden almacenar a -20 °C durante 6-12 meses o a -80 °C durante un máximo de 3 años.</li>
</ol>4. Tinción BODIPY
<ol><li>Descongele los portaobjetos en un sistema de tinción de portaobjetos a RT durante 30 min.</li>
	<li>Lavar con 1x PBS (3x durante 5 min cada uno).</li>
	<li>Rodee la sección con una capa hidrófoba con un bolígrafo de barrera.</li>
	<li>Preparar 500 μg/ml de solución madre de BODIPY 493/503: Disolver 1 mg de BODIPY 493/503 en 2 ml de disolvente (90% DMSO; 10% 1x PBS). Proteger de la luz. Sonicar en un baño ultrasónico durante 1 h (9.5-10 W) a 37 °C. NOTA: La solución puede conservarse a -20 °C durante al menos 30 días.</li>
	<li>Preparar la solución de tinción BODIPY (1 μg/ml) añadiendo 2 μL de solución madre BODIPY 493/503 y 0,1 μL de solución madre DAPI (5 mg/ml) a 997,9 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos (75 μL/portaobjetos) con BODIPY 493/503 (1 μg/ml) y DAPI (0,1 μg/ml) a RT durante 40 min. NOTA: Mantenga las diapositivas en la oscuridad desde este paso en adelante.</li>
	<li>Lave las diapositivas con 1x PBS (3x durante 5 minutos cada una).</li>
	<li>Monte las guías con cubreobjetos utilizando un medio de montaje de fluorescencia, déjelas secar durante 30 minutos y séllelas con esmalte de uñas. NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a 4 °C hasta obtener imágenes.</li>
</ol>5. Cuantificación de lípidos
<ol><li>Mida los niveles séricos de colesterol total y TG utilizando un método y equipo automático y validado.</li>
	<li>Mida los niveles de TG hepática utilizando un kit de ensayo colorimétrico de triglicéridos (Tabla de materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
</ol>6. Adquisición de imágenes
<ol><li>Coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio confocal de escaneo láser.</li>
	<li>Para la visualización y adquisición de imágenes, utilice un microscopio confocal con una lente objetivo de 20x (plano-apocromático: 20x/0.8).</li>
	<li>Para evitar la diafonía entre el BODIPY 493/503 y DAPI, utilice el modo de escaneo secuencial (mejor señal) en el software confocal.</li>
	<li>Excite el BODIPY 593/503 usando la línea láser de argón de 488 nm y el DAPI usando la línea láser de 405 nm. Establezca los rangos de emisión en 493-589 nm para BODIPY 493/503 y en 410-464 nm para DAPI.</li>
	<li>Utilice los siguientes ajustes: estenopeico: 1 UA, resolución: 1.024 píxeles x 1.024 píxeles, profundidad de bits: 12, tamaño de píxel: 0,415 μm, modo bidireccional, velocidad de escaneo: 7 (~1,58 μs/píxel para un objetivo de 20x), promedio de línea: 2x y zoom digital: 1. NOTA: Los parámetros de escaneo mencionados anteriormente deben optimizarse para cada microscopio confocal y objetivo utilizado.</li>
	<li>Establezca la ganancia y la ganancia digital adecuadamente para que no se detecten píxeles saturados en el indicador de rango. NOTA: Corrija la señal de fondo ajustando el desplazamiento.</li>
	<li>Una vez identificados correctamente los LDs, adquirir la imagen con los canales BODIPY y DAPI. NOTA: Todas las imágenes deben adquirirse en las mismas condiciones (exposición y ajustes generales) para cada canal de color.</li>
	<li>Para crear imágenes de área amplia (Figura 2), cambie el objetivo a una lente de objetivo de 10x (plan-neofluar: 10x/0.3).</li>
	<li>Seleccione el modo Escaneo de mosaico y haga mosaicos de imágenes de 5 por 5. NOTA: En este trabajo, cada mosaico tenía una superposición del 10% para combinar adecuadamente los mosaicos para el análisis.</li>
	<li>Para crear vistas 3D y ortogonales (Figura 3A), coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y cambie el objetivo a una lente de objetivo de 40x (plano-neofluar: aceite 40x/1.30).</li>
	<li>Seleccione el modo Z-Stack y, ajustando el plano Z, defina la primera y la última posición para la adquisición con un corte óptico con un grosor óptimo (~0,5 μm) para garantizar que se capturen todas las gotas. NOTA: Para acelerar la adquisición de imágenes y evitar el blanqueamiento, el corte óptico se puede ajustar a un tamaño subóptimo, asegurando al menos un 30% de sobremuestreo para una buena reconstrucción 3D.</li>
	<li>Seleccione el módulo Orto y cree vistas ortogonales.</li>
	<li>Adquiera imágenes 3D seleccionando el módulo 3D siguiendo el modo de representación de transparencia con el software de microscopio confocal.</li>
</ol>7. Análisis de imágenes
<ol><li>Procese y analice las imágenes de un solo plano (aumento de 20x) con CellProfiler (versión 4.2.5). NOTA: La tubería utilizada en este trabajo fue adaptada de Adomshick et al.45.</li>
	<li>Haga clic en el módulo Imágenes en la esquina superior izquierda de la ventana de CellProfiler y cargue las imágenes como .tiff archivos.</li>
	<li>Utilice el módulo NamesAndTypes para ordenar entre imágenes teñidas con BODIPY- (droplet) y DAPI- (núcleos) en función de los nombres de archivo. Realice el análisis LD solo con imágenes teñidas con BODIPY.</li>
	<li>Para iniciar la construcción de la canalización, haga clic en Ajustar módulos y seleccione el módulo ColorToGray para convertir las imágenes en imágenes en escala de grises. NOTA: Para identificar objetos, se requieren imágenes en escala de grises.</li>
	<li>Identifique gotas empleando el módulo IdentifyPrimaryObjects utilizando la imagen en escala de grises. NOTA: Los parámetros de este módulo deben ajustarse para lograr una buena identificación de LD. En este trabajo, la definición de LD con un tamaño entre 6 píxeles y 300 píxeles y un factor de corrección de umbral de 1.0 condujo a la identificación más precisa.</li>
	<li>Para medir la intensidad de píxeles de las gotas de lípidos identificadas, agregue un módulo MeasureObjectIntensity .</li>
	<li>Agregue un módulo FilterObjects adicional para garantizar que solo se cuantifiquen las señales más fuertes, mientras que las señales menos intensas se excluyen del análisis final de gotas de lípidos (intensidad mínima: 0.15; intensidad máxima: 1 unidad arbitraria).</li>
	<li>Para medir los LD relacionados con los datos de salida, agregue el módulo MeasureObjectSizeShape .</li>
	<li>Agregue un módulo OverlayOutline en este punto para superponer la gota identificada en la imagen original y, por lo tanto, asegúrese de que la segmentación también se vea precisa en la imagen sin procesar. NOTA: Este es un paso opcional (control de calidad).</li>
	<li>Agregue un módulo ExportToSpreadsheet al final y haga clic en el botón Analizar imágenes en la esquina inferior izquierda.</li>
</ol>8. Análisis estadístico
<ol><li>Expresar los resultados como media ± error estándar de la media (S.E.M.) utilizando cualquier aplicación de software de análisis estadístico. NOTA: En este estudio, se utilizó el software GraphPad para el análisis estadístico.</li>
	<li>Analice la distribución de valores utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar desviaciones significativas de la normalidad. Analice los datos paramétricos utilizando la prueba t no pareada del estudiante. NOTA: Los valores de p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.</li>
</ol>

Evaluación de la esteatosis hepática con reconstrucción de gotas lipídicas con fluorescencia 3D

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la evaluación de LD tuvo como objetivo desarrollar un nuevo enfoque de imagen para la evaluación de la esteatosis hepática. Dada la fuerte correlación entre la obesidad y la enfermedad del hígado graso, se utilizó la dieta alta en grasas al estilo occidental para establecer un modelo animal de esteatosis hepática26. Un aumento robusto en el contenido de TG hepática fue confirmado por un kit de ensayo colorimétrico cuantitativo de ...

Las gotas de lípidos (LD), clásicamente vistas como depósitos de energía, son orgánulos celulares especializados que median el almacenamiento de lípidos, y comprenden un núcleo lipídico neutro hidrófobo, que contiene principalmente ésteres de colesterol y triglicéridos (TG), encapsulados por una monocapa de fosfolípidos 1,2,3.
La biogénesis de LD ocurre en el retículo endoplásmico (RE), comenzando con la síntesis de triacilglicerol (TAG) y ésteres de esteroles. Los lípidos neutros se difunden entre las valvas de la bicapa ER a bajas concentraciones, pero se unen en lentes de aceite que crecen y brotan en gotitas casi esféricas de la membrana ER cuando su concentración intracelular aumenta4. Posteriormente, las proteínas de la bicapa ER y el citosol, particularmente la familia de proteínas perilipina (PLIN), se translocan a las superficies de las LD para facilitar la gemación 5,6,7,8,9.
A través de la síntesis de nuevos ácidos grasos y la fusión o coalescencia de LD, los LD crecen en diferentes tamaños. En consecuencia, el tamaño y el número de LD difieren considerablemente entre los diferentes tipos de células. Las pequeñas gotas (300-800 nm de diámetro), que se conocen como LD iniciales (iLDs), pueden ser formadas por casi todas las células4. Más adelante en la formación de LD, la mayoría de las células son capaces de convertir algunos iLD en LD más grandes que se expanden (eLD >1 μm de diámetro). Sin embargo, solo tipos celulares específicos, como los adipocitos y los hepatocitos, tienen la capacidad de formar LD gigantes o de gran tamaño (hasta decenas de micras de diámetro)4,10.
Las LD juegan un papel muy importante en la regulación del metabolismo lipídico celular, suprimiendo la lipotoxicidad y previniendo el estrés del RE, la disfunción mitocondrial y, en última instancia, la muerte celular causada por ácidos grasos libres (AF)11,12,13,14. Además, las LD también han sido implicadas en la regulación de la expresión génica, el secuestro de proteínas de replicación viral y el tráfico y señalización de membranas15,16,17. Por lo tanto, la mala regulación de la biogénesis de LD es un sello distintivo de las enfermedades crónicas asociadas con el síndrome metabólico, la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y / o la arteriosclerosis, por nombrar solo algunas 18,19,20.
El hígado, como centro metabólico, es el principal responsable del metabolismo de los lípidos mediante el almacenamiento y procesamiento de lípidos, y, por lo tanto, está constantemente amenazado por la lipotoxicidad21. La esteatosis hepática (HS) es una característica común de una serie de enfermedades hepáticas progresivas y se caracteriza por una acumulación excesiva de lípidos intracelulares en forma de LD citosólicas que, en última instancia, pueden conducir a disfunción metabólica hepática, inflamación y formas avanzadas de enfermedad del hígado graso no alcohólico22,23,24,25. La HS ocurre cuando la tasa de oxidación de ácidos grasos y exportación como triglicéridos dentro de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) es menor que la tasa de absorción de ácidos grasos hepáticos de la síntesis plasmática y de novo de ácidos grasos26. La acumulación hepática de lípidos ocurre a menudo en dos formas, esteatosis microvesicular y macrovesicular, y éstas presentan características citoarquitectónicas distintas27. Típicamente, la esteatosis microvesicular se caracteriza por la presencia de pequeñas LDs dispersas por todo el hepatocito con el núcleo colocado centralmente, mientras que la esteatosis macrovesicular se caracteriza por la presencia de una sola LD grande que ocupa la mayor parte del hepatocito, empujando el núcleo hacia la periferia28,29. En particular, estos dos tipos de esteatosis a menudo se encuentran juntos, y no está claro cómo estos dos patrones de LD influyen en la patogénesis de la enfermedad, ya que la evidencia aún es inconsistente31,32,33,34. Sin embargo, ese tipo de análisis se emplea a menudo como un "estándar de referencia" en estudios preclínicos y clínicos para comprender el comportamiento dinámico de los LD y caracterizar la esteatosis hepática 29,34,35,36.
Las biopsias hepáticas, el estándar de oro para diagnosticar y clasificar la HS, se evalúan rutinariamente mediante análisis histológico de hematoxilina y eosina (H&E), donde las gotitas de lípidos se evalúan como vacuolas no teñidas en secciones hepáticas teñidas con H&E37. Aunque aceptable para la evaluación de la esteatosis macrovesicular, este tipo de tinción generalmente estrecha la evaluación de la esteatosis microvesicular38. Los colorantes diazosolubles en lípidos, como Oil Red O (ORO), se combinan clásicamente con microscopía de campo claro para analizar las reservas de lípidos intracelulares, pero todavía tienen una serie de desventajas: (i) el uso de etanol o isopropanol en el proceso de tinción, que a menudo causa la interrupción de los LD nativos y la fusión ocasional a pesar de que las células están fijadas39; ii) el carácter lento, ya que la solución ORO requiere la disolución y el filtrado del polvo fresco debido a la vida útil limitada, lo que contribuye a resultados menos consistentes; (iii) y el hecho de que ORO tiñe más que solo gotas lipídicas y a menudo sobreestima la esteatosis hepática38.
En consecuencia, los fluoróforos lipofílicos permeables a las células, como el rojo del Nilo, se han utilizado en muestras vivas o fijas para superar algunas de las limitaciones antes mencionadas. Sin embargo, la naturaleza no específica del etiquetado de orgánulos lipídicos celulares reduce repetidamente las evaluaciones de LD40. Además, las propiedades espectrales del Rojo del Nilo varían según la polaridad del medio ambiente, lo que a menudo puede conducir a cambios espectrales41.
La sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (longitud de onda de excitación: 480 nm; emisión máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibe características de hidrofobicidad que permiten su rápida absorción por LD intracelular, se acumula en el núcleo de gotas lipídicas y, posteriormente, emite fluorescencia verde brillante12. A diferencia del Nile Red, BODIPY 493/503 es insensible a la polaridad del entorno y se ha demostrado que es más selectivo, ya que muestra un alto brillo para imágenes LD. Para teñir LDs neutros, este colorante puede ser utilizado en células vivas o fijas y acoplado con éxito con otros métodos de tinción y/o etiquetado42. Otra ventaja del tinte es que requiere poco esfuerzo para colocarlo en una solución y es estable, eliminando así la necesidad de prepararlo recién para cada experimento42. A pesar de que la sonda BODIPY 493/503 se ha empleado con éxito para visualizar la localización y la dinámica de LD en cultivos celulares, algunos informes también han demostrado el uso confiable de este colorante como una herramienta de imagen LD en tejidos, incluido el músculo vasto lateral humano43, el músculo sóleo de rata42 y el intestino de ratón44.
En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en BODIPY 493/503 como un enfoque analítico alternativo para la evaluación del número, área y diámetro de LD en muestras hepáticas de un modelo animal de esteatosis hepática. Este procedimiento cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, las condiciones de tinción, la adquisición de imágenes y el análisis de datos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos especializados que median el almacenamiento de lípidos y desempeñan un papel muy importante en la supresión de la lipotoxicidad y la prevención de la disfunción causada por los ácidos grasos libres (FA). El hígado, dado su papel crítico en el metabolismo de las grasas del cuerpo, está persistentemente amenazado por la acumulación intracelular de LD en forma de esteatosis hepática microvesicular y macrovesicular. La caracterización histológica de los LD se basa típicamente en colorantes diazo solubles en lípidos, como la tinción Oil Red O (ORO), pero una serie de desventajas dificultan consistentemente el uso de este análisis con muestras de hígado. Más recientemente, los fluoróforos lipofílicos 493/503 se han vuelto populares para visualizar y localizar LD debido a su rápida absorción y acumulación en el núcleo de gotas de lípidos neutros. Aunque la mayoría de las aplicaciones están bien descritas en cultivos celulares, hay menos evidencia que demuestre el uso confiable de sondas de fluoróforos lipofílicos como una herramienta de imagen LD en muestras de tejido. En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en diprometeno de boro (BODIPY) 493/503 para la evaluación de LD en muestras de hígado de un modelo animal de esteatosis hepática inducida por dieta alta en grasas (HFD). Este protocolo cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, la tinción BODIPY 493/503, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Demostramos un aumento del número, la intensidad, la relación de área y el diámetro de LD hepáticas al alimentarse con HFD. Usando proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, fue posible observar el contenido completo de lípidos neutros en el núcleo LD, que aparecieron como gotitas casi esféricas. Además, con el fluoróforo BODIPY 493/503, pudimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermedias (3 μm < d ≤ 9 μm) y macrovesículas (d > 9 μm), permitiendo la discriminación exitosa de esteatosis microvesicular y macrovesicular. En general, este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 es una herramienta fiable y sencilla para la caracterización hepática de LD y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

Autor destacado: Análisis de gotas de lípidos teñidas con fluorescente con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática  

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

La ejecución exitosa de esta técnica debe resultar en una tinción clara de gotas lipídicas para la caracterización simultánea de la morfología LD (forma y densidad del núcleo lipídico basada en la reconstrucción 3D) junto con su distribución espacial, número por área total y tamaño promedio (evaluado con la tubería descrita anteriormente, Figura 1).
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En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Este enfoque de imagen permite la reconstrucción tridimensional de la deposición de gotas lipídicas hepáticas y supera las principales desventajas de la tinción histológica clásica que redujo la discriminación exitosa entre la esteatosis micro y macrovesicular. La evaluación de la esteatosis microvesicular es cuando se utilizan tinciones histológicas estándar de oro, tanto como Oil Red, debido a la interrupción y la fusión ocasional de gotas de lípidos nativos. El pro-BODIPY ofrece una alternativa a los protocolos rutinarios para la evaluación de la esteatosis hepática microvesicular debido a su correcta hidrofobicidad para una rápida absorción y un etiquetado efectivo de las gotas de lípidos, siendo no solo insensible a la polaridad del entorno, sino también extremadamente selectivo.Este enfoque de imagen abarca aplicaciones más amplias en combinación con técnicas inmunoquímicas, lo que permite la detección simultánea de otros antígenos subcelulares que pueden avanzar en el estudio de la biogénesis y la dinámica de las gotas lipídicas, sustentando la esteatosis hepática micro y macrovesicular.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K vistas.  University of Coimbra. Este enfoque de imagen permite la reconstrucción tridimensional de la deposición de gotas lipídicas hepáticas y supera las principales desventajas de la tinción histológica clásica que redujo la discriminación exitosa entre la esteatosis micro y macrovesicular. La evaluación de la esteatosis microvesicular es cuando se utilizan tinciones histológicas estándar de oro, tanto como Oil Red, debido a la interrupción y la fusión ocasional de gotas de lípidos nativos. El pro-BODIPY ofr...

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Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Investigación

Bioquímica

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

Sección de tejido hepático congelado y tinción BODIPY de gotas de lípidos

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.