Este protocolo permite obtener imágenes de embriones de ratón a medida que se desarrollan. Esto permite estudiar la cardiogénesis temprana en detalle. Al igual que tomar imágenes fijas de embriones falsos, las imágenes en vivo brindan acceso completo al proceso dinámico de estudio en el desarrollo embrionario.
Las habilidades requeridas para las imágenes de la vida son difíciles de comprender a partir de la publicación de solo texto. Ver a otra persona hacerlo es esencial para aprender. Para comenzar, corte trozos de alambre de tungsteno de un centímetro de largo y afilarlos a 0.02 a 0.05 milímetros de diámetro sumergiendo la punta del alambre en una solución saturada de nitrato de sodio.
Para preparar capilares de vidrio con codo, coloque el punto medio de un capilar de vidrio estándar de un milímetro sobre un encendedor de bunsen durante tres a seis segundos, tirando lentamente de ambos extremos hasta que el capilar se vuelva delgado y flexible. Luego, rompe el capilar por la mitad y caliéntalo brevemente para producir una curva de 90 grados a dos centímetros de la punta. Vio una pieza de polimetacrilato de metilo que mide aproximadamente siete milímetros de largo, cuatro milímetros de ancho y dos milímetros de espesor.
Sostenga la pieza de metacrilato usando un vicio de banco, luego perfore agujeros personalizados transversalmente a través de toda la pieza. Gire el taladro lentamente mientras aplica una presión baja pero constante. Utilice una lima fina para suavizar el borde del soporte y ajustar su tamaño.
Además, cree una pendiente suave en los bordes del soporte para facilitar el posicionamiento del embrión. Coloque el soporte terminado en un plato con agua destilada para enjuagarlo. Bajo el microscopio estéreo, revise el soporte para ver si los orificios contienen polvo de perforación.
Si hay polvo, use agujas de tungsteno para eliminarlo. Para esterilizar el soporte, colóquelo en un tubo cónico lleno de agua destilada y sonicar durante 20 minutos con un mínimo de 20 vatios de potencia de salida. Extraiga el útero de una ratona embrionaria eutanasiada del día 6.75 a 7.5 y colóquelo en una toallita de papel seca y limpia.
Luego, corte el útero, insertando la punta de las tijeras finas desde el lado mesometrial y deslizando la cuchilla para exponer los decidui, y transfiéralos al medio de disección. Diseccionar los embriones, manteniendo intacto el cono ectoplacentario. Luego, retire la membrana del Reichter, dejando parte de ella en la región embrionaria adicional.
Para mantener la disección medio caliente, reemplácela cada 10 minutos. Además, disecciona los decidui en grupos de tres a cuatro mientras mantienes el resto en un medio de disección colocado en un baño de 37 grados centígrados. Colocar inmediatamente los embriones disecados en un medio de cultivo.
Seleccione los embriones con las características de fluorescencia deseadas utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colóquelos en el tubo que contiene el medio de cultivo en la incubadora de cultivo celular para recuperarlos durante dos horas antes de la obtención de imágenes. Después de encender todos los componentes del microscopio, incluyendo la computadora, el software y los láseres, encienda el controlador de dióxido de carbono y configúrelo al 7%Coloque una gota de grasa de silicio de alto vacío en un plato de 35 milímetros con un fondo deslizante de cubierta de vidrio. Coloque el soporte encima de la gota y presione suavemente para inmovilizarlo.
Para el montaje de embriones, transfiera de dos a tres embriones de la incubadora al plato con un soporte. Usando un par de pinzas y una aguja de tungsteno cónica, coloque los embriones en los agujeros. Use la aguja para enganchar el embrión por el cono ectoplacentario e insértelo en un orificio de tamaño equivalente.
Mueva con cuidado el plato que contiene los embriones y el soporte a la placa del microscopio. Baje el objetivo hasta que se forme un menisco líquido en la interfaz del objetivo medio. Después de colocar el embrión enfocado, monte la cámara de incubación y séllela alrededor del objetivo con cinta adhesiva.
Usando una captura en vivo en el software de control del microscopio, ajuste la salida del láser y los niveles de ganancia. Luego, cubra el medio con aceite de parafina goteándolo lentamente sobre el objetivo. Configurar una grabación de lapso de tiempo.
Establezca un intervalo de cinco a 10 minutos con un espacio Z de tres a cinco micras entre pilas. Deje un espacio en blanco encima de la Z-Stack para anticipar el crecimiento del embrión. Un mínimo de 50 micras, añadiendo 30 micras por cada hora que la adquisición no será supervisada.
Habilite la opción de guardado automático para permitir la supervisión de la adquisición desde una computadora para permitir el ajuste del tamaño Z-Stack si es necesario, para que se ajuste al área de interés dentro del foco. Se muestra el desarrollo del corazón de un embrión de cuerpo entero vivo mediante imágenes multifotónicas. En el día embrionario 7.5, la fluorescencia venosa está presente en todo el ectodermo neural, con algunos núcleos positivos en el mesodermo esplácnico y extra embrionario.
Después de cuatro horas, los progenitores endoteliales se activan venosos y se ensamblan para formar el tubo endocárdico y las aortas subyacentes, que se convierten en estructuras cerradas después de siete horas. Tenga cuidado al quitar la membrana del Reichter. Puede estar realmente pegado al embrión, especialmente en las etapas de prevacilación.
Durante la extracción, trate de pellizcar la membrana por la región embrionaria adicional.
