Этот метод будет фундаментальным для понимания гаструляции вдоль образования у млекопитающих. Позволяя экспериментировать с живыми эмбрионами во время эмбриональных стадий, которые долгое время были скрыты внутри материнской матки. Это позволяет, продолжает эффективный и соответствующий рост эмбрионов мыши вне матки в течение длительного периода до 6 дней.
Быстрое и адекватное рассечение эмбриона и прегаструляция концентрации и давления газа являются наиболее важными шагами для успешного роста эмбриона. Чтобы начать культивирование эмбрионов мыши 7,5-дневного возраста или более продвинутых, включите ротатор и нагревательный блок системы инкубатора роликовых культур не менее чем за 1 час до вскрытия эмбриона. Кроме того, добавьте автоклавную воду в газовый входной баллон и выходную пробирку.
Затем включите модуль газового регулятора, нажав на главный переключатель, затем используйте соответствующие контроллеры, чтобы установить значения кислорода и углекислого газа на 5% Откройте газовый регулятор и переместите переключатель напряжения в преобразователе давления, чтобы установить давление газа примерно на 6,5-7 фунтов на квадратный дюйм. Подтвердите значение давления газа с помощью цифрового манометра. Контролируйте поток газа, проверяя скорость пузырьков, создаваемых внутри заполненной водой пробирки, выделенной внутри прецизионного инкубатора.
Установите правильную скорость пузырьков, закрыв или открыв клапан потока газа на крышке бутылки с водой. Убедитесь, что поток газа позволяет образовывать пузырьки со скоростью от 2 до 4 пузырьков в секунду или установите пузырьковый поток в первой точке, где пузырьки выходят в заполненную водой выпускную трубку. Далее наполните бутылки культуры 2 миллилитрами питательной среды.
Используйте полые силиконовые бунги, чтобы запечатать бутылки и заткнуть их в полый вращающийся барабан для предварительного уравновешивания в течение 1 часа. Держите пустые пространства во вращающемся барабане герметичными с помощью сплошных бунгов. Затем рассекайте эмбрионы от усыпленной беременной самки мыши.
Очистите живот 70% этанолом и срежьте кожу и брюшную стенку ножницами. Найдите один конец матки и разрезайте на пересечении между яичником и маткой. Продолжайте разрезать вдоль матки до другого конца и переложите на 100-миллиметровую чашку Петри, наполненную DPBS.
Быстро мойте концептуалы в DPBS и разрезайте попарно, чтобы облегчить обработку эмбрионов. Переместите все пары концептусов в предварительно уравновешенную среду для рассечения в 60-миллиметровой чашке Петри, затем разделите на отдельные концептуусы. Далее, используя пару грубых щипцов, удаляют стенку матки концептусов путем разрыва ткани матки, затем с помощью мелких, микрохирургических щипцов срезают кончик грушевидной децидуа.
Вставьте щипцы рядом с эмбрионом параллельно его длинной оси и откройте щипцы, чтобы разделить децидуу на половинки. Наконец, используя тонкие щипцы, схватите эмбрион от децидуа и снимите теменной желточный мешок с эмбриона, оставив неповрежденный эктоплацентарный конус, прикрепленный к цилиндру яйца. Выберите эмбрионы в нервной пластинке или ранней стадии складки головы, которые не показывают повреждений в эпибласте.
Перенесите от 5 до 6 отобранных эмбрионов на флакон в предварительно уравновешенные стеклянные бутылочки для культивирования и поместите флаконы во вращающуюся культуральную систему при 37 градусах Цельсия, в атмосферу с 5% кислорода и 5% углекислого газа. Для культивирования эмбрионов и статической пластины предварительной и ранней гаструляции добавляют 250 микролитров свежеприготовленной культуральной среды для внеутробных эмбрионов в каждую лунку 8-луночной пластины. Поместите пластины внутрь инкубатора углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия для предварительного уравновешивания.
После вскрытия эмбрионов из матки, как показано ранее, перенесите отдельные эмбрионы в каждую лунку 8-луночной пластины с помощью микропипетки и поместите пластину внутри инкубатора с 5% углекислым газом при 37 градусах Цельсия. Визуализируйте эмбрионы под стереомикроскопом и выбирайте для культивирования только те, которые имеют хорошо сформированную амниотическую полость без видимых повреждений и без мембраны Райхерта. Условия культивирования роликов, описанные в этом протоколе для 7,5-дневных эмбрионов, поддерживают постоянный и нормальный рост эмбриона со средней эффективностью, близкой к 75% через 4 дня культивирования.
Эффективность развития эмбриона варьируется в зависимости от различных генетических фонов мышей, но неизменно надежна. Добавки с HBS вместо HCS дают эффективность примерно 68% после 4 дней культивирования. Развитие 6,5 эмбрионов и статических пластин правильно рекапитулируется с эффективностью более 90% с использованием культуральной среды ex-utero embryo как с HCS, так и с HBS.
Культуры, начиная с прегаструлирующих эмбрионов, показывают 46% эффективность правильного развития до ранней стадии сомита и почти 17% эмбрионов завершают правильное развитие после 6 дней культивирования. Морфогенез и развитие тканей протекают должным образом до 42 сомитов. Репрезентативные дефекты развития, наблюдаемые у эмбрионов для культур, начатых с эмбрионального дня 7,5, 6,5 и 5,5, показаны здесь.
Эмбрионы с незначительным повреждением эпибласта или эмбрионы, удерживающие мембрану Райхерта, должны быть выброшены. Ранние эмбрионы не будут расти должным образом или демонстрировать серьезные задержки развития, в то время как прикрепление эмбрионального эпибласта к поверхности пластины приведет к сбою дальнейшего развития эмбриона. Основными аномалиями, наблюдаемыми у дефектных эмбрионов, являются развитие задней области вне желточного мешка или дефекты роста нервных складок.
В культурах, выведенных из 5,5-дневных эмбрионов, часто наблюдается дефект развития — наличие небольшого, недоразвитого эпибласта. Используя этот метод, исследователи могут выполнять различные физические или химические манипуляции при разработке постимплантированных эмбрионов. Например, манипуляции, клеточная трансплантация или отслеживание родословной.
Этот метод не только прокладывает путь для детального изучения развития постимплантации мышей, но и для реализации аналогичных методов культивирования эмбрионов других видов, таких как человек.
