El objetivo general de este procedimiento es producir y purificar el oviducto BDNF en un protocolo optimizado que implica la transfección de células HEK293 y la purificación en una columna de cromatografía. El oviducto BDNF es entonces monobiocrílico por una reacción in vitro para el etiquetado y la detección posteriores por microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de este procedimiento es que permite la producción, purificación y monobioniización de BDNF de una manera optimizada.
Los parámetros de gestación se han optimizado para la máxima producción de BDNF utilizando un reactivo de transfección rentable y el proceso de purificación se realiza en una configuración de cromatografía que facilita la manipulación y permite escalar el procedimiento. Comience diluyendo 60 microgramos de polietilenimina en 500 microlitros de DMEM no suplementado y 20 microgramos de plásmido de oviducto BDNF en 500 microlitros de DMEM no suplementado por plato de 15 centímetros para ser trans infectado. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego pipetear cuidadosamente la solución de ADN en un tubo de polietilenimina, mezclando una vez por movimiento arriba/abajo.
Incubar durante 25 minutos a temperatura ambiente y luego gotear un mililitro de la mezcla PEI/ADN a lo largo de cada plato de 15 centímetros. Incubar las células con la mezcla PEI/ADN durante tres horas y luego cambiar el medio a tampón de incubación. 48 horas después de la transfección de las células, recoger el medio de todos los platos.
A continuación, agregue los componentes medios BDNF al sobrenadante HEK293, incluidos el cloruro sódico, los componentes tamponados con fosfato, el imidazol y los inhibidores de la proteasa. Incubar en hielo durante 15 minutos. A continuación, aliquot el medio en tubos centrífugos.
Centrifugar durante 45 minutos a 10.000 g en una centrífuga de oro de cuatro grados Celsius. Este paso permite la eliminación de desechos celulares y células muertas suspendidas en los medios. A continuación, recoger los sobrenadantes.
Añadir BSA a una concentración final de 0.1% y almacenar en menos 20 grados Celsius durante un máximo de dos meses. Para purificar el BDNF, comience descongelando los medios en un baño termorregulado de 37 grados Celsius. A continuación, aliquot el medio en tubos centrífugos.
Centrífuga durante una hora a 3.500 g en una centrífuga de oro de cuatro grados Celsius. Este paso permite la eliminación de los residuos restantes para asegurar un flujo adecuado a través de la columna de cromatografía. A continuación, utilice los concentradores de proteínas para reducir los medios de 500 mililitros a 100 mililitros.
Siga los parámetros de centrifugación recomendados por el fabricante para una concentración óptima. A continuación, agregue 500 microlitros de cuentas de agarosa de níquel-NTA a los medios concentrados e incubar durante la noche en un balancín a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, ensamble el aparato de cromatografía y vierta los medios en él.
Deje reposar durante cinco minutos y luego abra la polla de parada bidireccional para dejar que el medio fluya a través. Lavar con cinco mililitros de tampón de lavado durante cinco minutos asegurándose de resuspender las cuentas en la columna. Repita tres veces.
Por último, agregue un mililitro de búfer de elución a la columna asegurándose de resuspender las cuentas. Incubar durante 15 minutos y luego recoger el eluyente en un tubo de microcentrífuga. Repita este paso tres veces para la elución completa de BDNF.
Para biotinilinear el BDNF, tome una alícuota que contenga 800 nanogramos de la proteína y agregue el reactivo tampón de biotinilación y luego un poco de BirA-GST en una relación molar uno a uno con BDNF. Incubar en un horno de hibridación a 30 grados centígrados durante 60 minutos, mezclando el contenido del tubo cada 15 minutos por inversión. Luego agregue el mismo volumen de ATP y BirA-GST que en el primer paso e incubar durante 60 minutos, mezclando el contenido del tubo cada 15 minutos.
El BDNF biotinilado se puede dejar en hielo para la verificación inmediata de la biotinilación o almacenarse a menos 80 grados centígrados para el análisis posterior. Para verificar la biotinilación del oviducto BDNF, comience bloqueando 30 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina por muestra de BDNF en un tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante una hora y luego precipitar las perlas magnéticas en un separador de rack magnético y luego desechar el búfer de bloqueo.
Agregue 50 microlitros de tampón de bloqueo fresco y la muestra de BDNF a las perlas, asegurándose de resuspenderlas completamente. Homogeneizar el contenido del tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante una hora en un rotador de tubo de microcentrífuga. Preparar la muestra para la hinchazón occidental como se describe en el texto para evaluar la eficiencia de la reacción de biotinilación.
Para conjugar el oviducto BDNF con los puntos cuánticos, comience agregando el volumen necesario de puntos cuánticos para lograr una relación molar uno a uno con BDNF y luego diluir a un volumen final de 20 microlitros. Homogeneizar el contenido del tubo y luego envolverlo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en un balancín.
A continuación, diluya el oviducto BDNF a la concentración final deseada y agréguelo al compartimiento axonal de una cámara microfluídica, incubando durante 210 minutos para la toma de imágenes celulares posteriores vivas o fijas. El uso de un protocolo basado en columnas de cromatografía permite el procesamiento de volúmenes significativos de medios condicionados HEK293. En este experimento, se procesaron 500 mililitros de medios condicionados para purificar el oviducto BDNF.
Cuatro eluciones consecutivas que duraron 15 minutos cada una de las siguientes concentraciones de oviducto BDNF que oscilaban entre seis y 28 nanogramos por microlitro. El rendimiento total ascendió a aproximadamente 60 microgramos de BDNF oviduct. Este BDNF purificado fue entonces biotinilado por una reacción in vitro mediada por BirA-GST.
La muestra fue biotinilada de forma homogénea como lo demuestra la falta de oviducto BDNF no biotinilorado en el sobrenadante del tampón de perla magnética. Estos resultados muestran que el protocolo propuesto permite la purificación de cantidades significativas de oviducto BDNF y homogénea monobionilación in vitro. A continuación, se evaluó la actividad biológica del BDNF monobionitilado utilizando dos enfoques experimentales diferentes.
En primer lugar, las neuronas corticales sembradas en placas de 60 milímetros fueron estimuladas con 50 nanogramos por mililitro de BDNF monobiotinilado durante 30 minutos y luego se prepararon proteínas para el análisis de manchas occidentales. La actividad biológica del BDNF monobionitilado se cuantificó mediante la detección de fosfo-TrkB y fosfo-ERK. La unión de BDNF a TrkB desencadena la fosforilación automática del receptor y la activación de varias quinasas aguas abajo, incluida la ERK.
Para el análisis de la actividad biológica del oviducto de BDNF se incluyó una condición de control negativa que no fue estimulada con BDNF disponible comercialmente. Las bandas eran proteínas fosforiladas, tenían una intensidad similar en las neuronas tratadas con BDNF comercial y BDNF monobionicionado, y ambas mostraron una señal más fuerte que la condición de control negativo. A continuación, se evaluó la actividad biológica del BDNF monobiotinilo acoplado a los puntos cuánticos de estreptavidina para demostrar que se pueden utilizar en experimentos de imágenes en vivo.
Las neuronas corticales se sembraron en cubiertas de 10 milímetros y se trataron con una concentración final de 200 puntos cuánticos de BDNF picomolares o dos nanomolares durante 30 minutos antes de la fijación y tinción de fosfoo-CREB. CREB es un factor de transcripción que está dirigido por ERK12 activado en neuronas corticales. La estimulación de las neuronas con concentraciones crecientes de puntos cuánticos BDNF dio lugar a un aumento dependiente de la dosis de fosforilación de CREB y la presencia de partículas de puntos cuánticos que rodean el núcleo, lo que indica que las partículas de puntos cuánticos bdNF fueron endocadastadas y desencadenaron la activación de vías de señalización asociadas con la activación de TrkB mediada por BDNF.
Se detectó un aumento doble en la señal fosfo-CREB al estimular las neuronas con 200 puntos cuánticos picomolares BDNF, mientras que la estimulación con dos puntos cuánticos nanomolares BDNF dio lugar a un aumento de 3,5 veces en la señal fosfo-CREB. Por lo tanto, el oviducto BDNF biotinilo es biológicamente activo y no pierde su actividad cuando se combina con puntos cuánticos de estreptavidina, por lo que es adecuado para la inmunofluorescencia y la imagen de células vivas. Finalmente, el potencial de imagen de los puntos cuánticos BDNF se evaluó en cultivos compartimentados utilizando cámaras microfluídicas.
Las neuronas corticales se sembraron en cámaras microfluídicas para separar los compartimentos axonal y somatodendrítico y se estimularon con dos puntos cuánticos nanomolares BDNF durante 3,5 horas. Se realizó una microscopía de células vivas y se utilizaron los cifógrafos resultantes para cuantificar la velocidad de los puntos cuánticos de BDNF que contienen orgánulos. Se detectó una velocidad móvil media de 0,91 micrómetros por segundo que está en línea con el análisis previo del transporte mediado por timina citoplasmático.
Las cámaras microfluídicas tratadas con dos puntos cuánticos de estreptavidina nanomolar no mostraban puntos cuánticos en movimiento en los microcótuos como lo muestra el kymograph. Las células cultivadas en las mismas condiciones fueron estimuladas con 500 puntos cuánticos de BDNF picomolares o dos nanomolares durante 210 minutos y luego fijadas y etiquetadas con una mancha nuclear. Las neuronas tratadas con puntos cuánticos BDNF muestran una acumulación dependiente de la dosis de la proteína etiquetada en todos los subcompartimentos analizados, incluidas las porciones proximales y distales del microgrupo y el compartimento somatodendrítico.
Por el contrario, las neuronas de control no mostraron casi ninguna señal de punto cuántico en toda la cámara. Por lo tanto, el punto cuántico BDNF se puede detectar en células vivas y fijas en cámaras microfluídicas. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo producir el oviducto BDNF monobiotilado en un procedimiento rentable basado en columnas de cromatografía.
