Nuestra combinación de microdisección láser y espectrometría de masas permite la investigación de cambios espacialmente resueltos a nivel proteómico en cualquier tipo de tejido. En nuestro caso, gránulos de neuromelanina. Nuestro protocolo permite el análisis proteómico basado en material de muestra limitado.
Lo cual suele ser un gran desafío cuando se trabaja con tejido cerebral postmortem. Dado que las células individuales se pueden aislar para comparar condiciones sanas y de enfermedad a nivel proteómico. Esto puede mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad.
Para comenzar, coloque el portaobjetos de membrana de tejido en el portaobjetos en la etapa de robo con el tejido hacia arriba. Para adquirir una exploración general de la sección de tejido. Utilice la función de escaneo, seleccione el área de interés en las esquinas superior izquierda e inferior derecha.
A continuación, seleccione analizar todos los ROI para realizar el análisis. Para la selección automática de gránulos de neuromelanina en el campo de visión actual. Seleccione el análisis del campo de visión.
A continuación, seleccione invertir resultado y establezca el umbral para los canales RGB. De modo que solo los gránulos de neuromelanina se resaltan en rojo en la ventana de vista previa. Ahora haga clic en Aceptar, para usar la configuración ajustada para el campo de visión.
Ajuste la configuración del láser utilizando un área del portaobjetos cubierta únicamente por la membrana. Llene la tapa del tubo de recolección de muestras con 50 microlitros de agua ultrapura. E inserte la tapa en el colector del robot mover.
Usando la interfaz del software, coloque el robot mover sobre la etapa dos del robo para iniciar la recolección de muestras. Inicie el láser. Controle los ajustes de energía y enfoque durante el proceso láser y ajuste los ajustes si es necesario.
Asegúrese de aislar y catapultar adecuadamente los objetos aislados en la tapa del tubo de recolección de muestras para al menos los primeros 10 objetos. Cuando se complete el muestreo, navegue por el robot mover hasta su posición inicial y retire el tubo de recolección de muestras. Después de hilar las muestras por centrificación.
Seque las muestras durante 1,5 horas en un concentrador de vacío. Después de realizar la digestión tríptica como se describe en el texto. Prepare la muestra para el análisis de HPLC-MS disolviendo de 200 a 400 nanogramos de péptidos de muestra en un volumen definido de 0.1% TFA.
En entradas de viales de vidrio espectrométrico de masas inertes. Si la determinación de la concentración no es aplicable debido a una cantidad de muestra baja. Verifique la carga idéntica de la muestra comparando la corriente de iones total.
Comenzar el análisis de datos brutos proteómicos. Haga clic en cargar para cargar los archivos sin procesar en el software. Haga clic en establecer experimento para asignar los nombres de muestra.
Definir parámetros específicos del grupo. Agregue las modificaciones eligiendo la deamidación NQ, la oxidación M y el término N de carbamidometilación como modificaciones variables. y luego agregue carbamidometilación C como modificación fija.
Elija tripsina como enzima de digestión en la pestaña de digestión. En la pestaña de cuantificación sin etiqueta, agregue la opción LFQ y si se van a procesar más de 10 archivos, elija la opción LFQ rápida para acortar el tiempo de procesamiento. Garantizar que todos los demás parámetros específicos del grupo permanezcan en la configuración de fábrica.
Vaya a la pestaña de parámetros globales y agregue el archivo FASTA derivado de uniprot. org en la pestaña Secuencias. Modifique la regla de identificador en consecuencia.
Y agregue la taxonomía ID 9606 para Homo sapiens. Para la cuantificación de proteínas, elija péptidos únicos y de afeitar. Luego agregue la opción iBAQ como medida para la cuantificación de proteínas en la pestaña de cuantificación libre de etiquetas.
Asegúrese de que todos los demás parámetros globales permanezcan en la configuración de fábrica y haga clic en iniciar. Después de que el análisis se haya realizado con éxito, recupere los grupos de proteínas. Salida TXT.
Cargue los grupos de proteínas. TXT en el software de análisis. Agregue los valores de iBAQ como columnas principales y ordene todas las demás columnas según su tipo.
Filtre los señuelos y contaminantes filtrando las filas en función de la columna categórica y filtre los resultados en función de los valores válidos. Exporte la salida en formato txt para su posterior procesamiento. Y evaluar los resultados con respecto a la pregunta de investigación.
En el presente estudio, se identificaron 1.898 grupos de proteínas en NMG y 1.565 en el tejido SN circundante, de los cuales 1.384 se identificaron en ambas áreas de tejido. Por lo tanto, se identificaron 514 y 181 grupos de proteínas exclusivamente en el tejido NMG y SN, respectivamente. En las mediciones representativas del DDA.
Los valores ligeramente más altos de iBAQ en NMG en comparación con SN indicaron una mayor abundancia de la proteína citoplasmática dynien-1, cadena pesada 1 en NMG. Esta observación podría verificarse en experimentos PRM para el péptido ESPEVLLTLDILK. En el que se detectó una mayor abundancia de NMGs.
Basado en el área pico en el nivel MS1 y MS2. El paso más importante es, con mucho, el aislamiento de los NMG, ya que el resto del protocolo se basa en que este paso se realice correctamente. Después del procedimiento LMD, las muestras se pueden utilizar y procesar posteriormente para cualquier tipo de técnica ómica, como genómica, transcriptómica, proteómica o lipidómica.
