Este protocolo es significativo, ya que utiliza un método de visualización libre de manchas en lugar de la visualización basada en tinte en el tejido cerebral humano post mortem, que ayuda a preservar la integridad del ARN. La preservación del ARN es una gran ventaja en este protocolo, ya que es útil, no sólo en el tejido cerebral humano post mortem, sino también en otros tipos de tejido, con alta actividad RNase. Para comenzar, retire el tejido del congelador y colóquelo sobre hielo seco para transportarlo al criostato.
Coloque los cepillos limpios, el mandril y el tejido en el criostato durante al menos 20 minutos, para que alcancen la temperatura óptima. Para criostatos con cámaras duales y temperaturas de retención de muestras, ajuste la temperatura del objeto a menos 16 grados centígrados y la temperatura de la cámara a menos 18 grados centígrados. Establezca el espesor de sección del criostato en 14 micrómetros y el espesor de recorte en 30 micrómetros.
A continuación, limpie el escenario con una mezcla uno a uno de descontaminador RNase y 70%etanol, para evitar la congelación. Obtenga una nueva hoja de criostato desechable y límpielo con el descontaminador RNase. Coloque la cuchilla limpia en el soporte de la cuchilla en el escenario.
A continuación, limpie la placa antivuelco con el descontaminador RNase. Fije la placa limpia al escenario y espere al menos 20 minutos para que la cuchilla y la placa antivuelco bajen a la temperatura del criostato. Primero, corte un pequeño pedazo de tejido para segar, asegurándose de que la sección es aproximadamente 95%corteza cerebelosa.
Devuelva el tejido restante al hielo seco o a un congelador, a menos 80 grados centígrados. A continuación, comience a agregar OCT lentamente en la parte superior del mandril con un movimiento lento y circular. Construir capas de OTC hasta que haya un montaje de aproximadamente tres milímetros de alto cubriendo el mandril.
Cuando el PTU esté parcialmente congelado, pero todavía tiene algo de líquido en el centro, coloque los tejidos en la parte superior del soporte. Deje que el tejido se siente encima del PTU durante uno o dos minutos hasta que esté completamente congelado. A continuación, transfiera el mandril con el OCT y el tejido congelados al brazo de corte criostato.
Ajuste el tejido de modo que quede al ras con la cuchilla de corte y deje que el tejido se siente en el brazo de corte durante 20 minutos para ajustarse a la nueva temperatura. El paso más crítico es permitir que el tejido se aclimate en el brazo de corte del criostato durante el tiempo que sea necesario. Si se tritura el tejido, la visualización de células de purkinje será muy difícil.
Recomiendo usar trozos de tejido más pequeños y delgados, para permitir que el tejido se aclimate más rápido. Después de esto, mueva lentamente el tejido más cerca de la hoja. Una vez que el tejido haya llegado a la cuchilla, comience el proceso de recorte.
Recorte el tejido de dos a tres veces, hasta que las capas de la corteza sean visibles. A continuación, coloque y alinee la placa estabilizadora justo encima de la hoja de criostato. Corte de cuatro a seis secciones de 14 micrómetros de espesor, teniendo en cuenta que las secciones correctamente cortadas serán planas debajo de la placa antivuelco.
Alinee las secciones de corte horizontalmente a través de la etapa de criostato. Angulo una diapositiva para recoger todas las piezas de tejido simultáneamente. Inmediatamente después de secciones del tejido, coloque la corredera en el portaobjetos con 70% de etanol sobre hielo durante dos minutos.
Transfiera la diapositiva a un portaobjetos con 95% de etanol sobre hielo durante 45 segundos. A continuación, coloque la diapositiva en el portaobjetos con 100% de etanol a temperatura ambiente durante dos minutos. Sumerja la diapositiva tres veces en el portaobjetos que contiene xileno número uno a temperatura ambiente.
A continuación, coloque la diapositiva en el portaobjetos con xileno dos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Ponga los portaobjetos en una campana limpia y déjelos secar al aire durante al menos 30 minutos. Si almacena los portaobjetos, coloque cada uno en un tubo separado de 50 mililitros y coloque los tubos en un congelador a menos 80 grados Centígrados durante un máximo de siete días.
En primer lugar, utilice el descontaminador RNase para limpiar la etapa del microscopio y el brazo de recogida de la tapa. Con las manos engunciadas, coloque la diapositiva en el microscopio y una tapa opaca de 500 microlitros en el brazo de la colección. Con un aumento bajo, alinee la tapa opaca sobre el tejido cerebeloso, asegurando que la tapa cubra toda el área que se visualiza en la pieza del ojo.
Utilice un objetivo de cinco a 10 veces para visualizar las capas cerebelosas. Coloque el cursor sobre la sección donde se intersecan la capa molecular y la capa celular granual. Mover a un aumento de 40 veces y visualizar las células purkinje.
Entonces, comienza a capturarlos. Para comenzar la recolección de ARN después de la microdisección, agregue 50 microlitros de tampón de lelisis celular a la tapa opaca con la tapa hacia arriba. Cierre cuidadosamente el tubo sobre la tapa y proceda con la colección como se describe en el protocolo de texto.
En este protocolo, el tejido cerebral humano fresco, congelado, post mortem, se prepara para la microdisección de captura láser UV. Después de la sección del criostato en el tiempo de dibujo asignado, las capas celulares del cerebelo son fácilmente visibles con lentes objetivo cinco y 10 veces. Como se ve aquí, la incubación adecuada de xileno hace que el tejido se vuelva más oscuro y delinea mejor las capas celulares que el etanol solo.
Al cortar en el microscopio de captura láser, se requiere la lente objetivo 40 veces para asegurar la captura de sólo células de purkinje y no el tejido circundante. Como se ve aquí, la incubación adecuada en xileno produce una imagen morfológicamente intacta de alta calidad en comparación con la fijación de etanol solo. La capacidad de deslizamiento de la cubierta de una tapa opaca se prueba entonces mientras que otros protocolos utilizan una tapa llena de líquido, estas tapas pueden reducir la visualización del tejido y hacer que la imagen resultante sea granular e iridiscente bajo el microscopio.
Sin embargo, la visualización a través de una tapa opaca da como resultado la apariencia del tejido suavizado que es más suave y nítida en forma. Imágenes representativas de células de purkinje extirpadas a baja potencia y a alta potencia muestran una eliminación precisa del cuerpo de la célula de purkinje. Después de esto, se obtiene Rnase de alta calidad para la secuenciación posterior de ARN.
Seis muestras representativas se sometieron a extracción de ARN y se resuspendieron en 14 microlitros de agua libre de arnse y las seis muestras produjeron ARN de alta calidad con números de integridad del ARN iguales o superiores a ocho. Lo más importante a recordar es que la calidad del tejido lo es todo. Incluso el corte y la colocación de diapositivas harán o romperán este protocolo.
Después de este procedimiento, se podría realizar cualquier método que investigue el ARN o el ADN, específicamente sondemos nuestro ARN en busca de expresión génica diferencial, pero también podrían investigarse otras cuestiones relativas a la regulación genética. Este método podría aplicarse a cualquier tipo de tejido que tenga morfología delineada específica que no requiera el uso de antígeno o reactivos específicos del tinte para la identificación de células de interés. Esperamos que esta técnica nos ayude a entender la genética del temblor esencial y otras enfermedades que tienen un fenotipo de temblor.
El producto químico más peligroso utilizado en este protocolo es el xileno. Debe manipularse correctamente en una campana de humo, desecharse correctamente y se debe permitir que las diapositivas se sequen adecuadamente hasta que se utilicen en un espacio abierto. Además, cuando se trabaja con muestras humanas, se debe utilizar la gestión de residuos biopeligrosos y la seguridad.
