Nuestro protocolo proporciona una metodología novedosa para crear lesiones cerebrales traumáticas en ratas que utilizan irradiación láser para crear un impacto de enfoque en la corteza motora. La principal ventaja de esta técnica son la baja variabilidad en el área de infarto, las bajas tasas de mortalidad y la relativa simplicidad del procedimiento que no requiere manejadores expertos. Demostrando el procedimiento estará Dmitry Natanel, un investigador de nuestro laboratorio.
Para realizar una lesión cerebral inducida por láser, primero asigne 20, 300 a 350 ratas Sprague Dawley en el grupo láser y 20 al grupo operado por Sham de control. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo de abstinencia, coloque una rata en una almohadilla de calentamiento regulada por temperatura rectal y use una afeitadora para eliminar suficiente vello del sitio de la lesión con un margen libre de pelo de aproximadamente dos centímetros alrededor de la incisión. Desinfectar la piel expuesta con 70% de etanol y colocar la rata en la posición propensa en un soporte de cabeza estereotaxico.
Haga una incisión de tres centímetros para permitir que el reflejo lateral del cuero cabelludo exponga el área entre bregma y lambda. Sosteniendo un láser Nd:YAG con una longitud de onda máxima de 1064 nanómetros a una distancia de dos milímetros del cráneo, administre 50 julios veces 10 puntos con una duración de pulso de un segundo al área expuesta del cráneo por encima del hemisferio derecho. Después de que se haya entregado la lesión láser, retire la rata del dispositivo y cierre el cuero cabelludo con suturas quirúrgicas de seda 3-0.
A continuación, coloque la rata en su jaula con supervisión hasta la plena reclinación. 24 horas después del procedimiento, utilice un sistema de puntuación de 43 puntos para evaluar la puntuación de gravedad neurológica. Probar a los animales en busca de déficits neurológicos, alteraciones del comportamiento, tarea de equilibrio de haces y reflejos, y asignar puntuaciones más altas para discapacidades más graves.
Después de la evaluación, cosecha los cerebros de cada animal experimental y control de acuerdo con los protocolos estándar. Para evaluar el volumen del infarto cerebral, secciona el cerebro cosechado en seis rodajas coronales de dos milímetros de espesor e incuba cada rebanada en 0.05%TTC durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después de la tinción, escanee estas rebanadas con un escáner óptico con una resolución de 1600 por 1600 puntos por pulgada.
Las áreas no manchadas de las rebanadas cerebrales fijas se definen como infarto. Para evaluar la incidencia de rotura de la barrera hematoencefálica, 24 horas después de que la lesión inducida por el láser cargue una jeringa con un tinte azul de 2%Evans diluido en cuatro mililitros por kilogramo de solución salina y entregue la solución por vía intravenosa a las ratas lesionadas y controle a través de la vena de cola cannulada. Deje que la solución circule durante una hora antes de usar pinciets quirúrgicos y tijeras para abrir el pecho del primer animal.
Perfunda el corazón expuesto con 0,9% de solución salina enfriada a través del ventrículo izquierdo a 110 milímetros de mercurio de presión hasta que se observe un líquido de profusión incoloro desde la aurícula derecha. A continuación, cosecha el cerebro y obtener dos rodajas caudales rostrales milimétricas. Separe las rebanadas cerebrales izquierdas de las rebanadas cerebrales derechas para permitir la evaluación de los hemisferios lesionados y no lesionados por separado, y pese las muestras.
Homogeneizar las muestras con un mortero y un mortero e incubar las muestras de tejido en 50%ácido tricloroacético durante 24 horas. Al día siguiente, centrifugar las muestras de tejido cerebral homogeneizada durante 20 minutos a 10.000 veces G y temperatura ambiente, y mezcle un mililitro del sobrenadante con 1,5 mililitros de 96% de etanol en una proporción de uno a tres. Luego, utilice un detector de fluorescencia en una excitación de 620 nanómetros y la longitud de onda de emisión de 680 nanómetros para evaluar la rotura de la barrera hematoencefálica.
Como se observa en el análisis histológico, la tinción azul de Evans se puede utilizar para revelar la incidencia de lesiones cerebrales en animales láser y modelo MCAO. En este análisis representativo no se registraron muertes ni hemorragias subaracnoideas ni en los grupos de control o experimentales, y el grupo MCAO tenía una tasa del 20% de mortalidad y hemorragia subaracnoidea. Los cambios relativos de la temperatura corporal en las ratas de ambos grupos también fueron similares, a pesar de una diferencia en la variabilidad de ambos grupos.
Las puntuaciones de gravedad neurológica fueron significativamente peores en los modelos láser y MCAO en comparación con el grupo de control operado por Sham. Inducido por láser a lesiones cerebrales también causó un aumento significativo en el volumen de infarto en el hemisferio objetivo en comparación con el grupo de control operado por Sham. Sin embargo, el volumen de infarto del modelo láser era menor en comparación con los animales heridos por la técnica MCAO.
No se observó ninguna diferencia en el edema cerebral entre el modelo de lesión cerebral inducida por láser y el grupo de control operado por Sham. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en el edema cerebral entre el modelo láser y los grupos lesionados de MCAO. En comparación con el grupo de control operado por Sham, las técnicas de lesión cerebral inducida por láser y MCAO causaron un aumento significativo en la rotura de la barrera hematoencefálica en los hemisferios no lesionados y objetivo.
Al intentar este modelo, recuerde apuntar con precisión al área de la corteza motora y estandarizar la energía, el número de puntos que se irradian y el tiempo total de exposición. Después de este procedimiento, se puede realizar una amplia plétora de pruebas conductuales, como caminar con haz, Froedert y otras evaluaciones.
