El objetivo general de este procedimiento es reproducir la mayoría de los aspectos esenciales de la enfermedad de Parkinson en un modelo animal. La entrega estereotáxica de vectores virales adenoasociados, codificando la sinucleína humana en la sustancia negra. La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que implica la muerte de la neurona dopaminérgica, en la vía nigrostriatal, y en consecuencia, la progresión de la pérdida de control del movimiento voluntario.
Este proceso neurodegenerativo se acompaña, por la deposición de agregados de proteínas en el cerebro, que están constituidas principalmente por sinucleína. La evidencia emergente ha indicado que los agregados de sinucleína pueden estimular receptores similares a toll en la microglía, lo que desencadena la inflamación neural en la sustancia negra. Además, la evidencia indica que los agregados de sinucleína pueden ser capturados y presentados, por las células presentadoras de antígenos a las células T, induciendo una respuesta inmune adaptativa específica a la sinucleína.
La administración estereotáxica de vectores virales adenoasociados que codifican la sinucleína humana en la sustancia negra, ha demostrado reproducir muchos aspectos esenciales de la enfermedad, incluida la patología de la sinucleína, la activación microglial, la activación de células T, la neurodegeneración y el deterioro motor. Este estudio presenta un análisis de cómo un vector viral y el tiempo después de la entrega del vector viral, afecta la extensión en la expresión de sinucleína humana, neurodegeneración y neuroinflamación en la vía nigrostriatal, así como el grado de deterioro motor en un modelo de ratón de administración estereotáxica unilateral de sinucleína humana en la sustancia negra. Para mantener un ambiente aséptico, use ropa quirúrgica adecuada durante toda la cirugía, incluyendo cubiertas de zapatos, máscara de cirugía, barrera sanitaria, guantes y gorra de cirugía.
Rocíe etanol sobre el ratón y todo el material quirúrgico, para mantener el ambiente aséptico. Para inducir una analgesia, inyecte carprofeno por vía subcutánea cada 12 horas, comenzando una hora antes de la cirugía y continuando hasta tres días después de la cirugía. Para anestesiar al ratón, coloque al animal en una cámara de inducción.
Abra el flujo de isoflurano a una velocidad del 0,5% y luego aumente lentamente hasta un 5% durante aproximadamente cinco minutos hasta que el ratón haya perdido su reflejo de enderezamiento. Retire al animal de la cámara de inducción. Transfiera inmediatamente al animal a un circuito sin rerespiración con un cono nasal del tamaño adecuado.
Mantener la anestesia del ratón, con isoflurano al 1% durante todo el tiempo de la cirugía. Confirme que el ratón está completamente anestesiado pellizcando sus colas y patas. Cuando el ratón no reacciona al pellizcar la cola y las patas, significa que el ratón está completamente anestesiado.
Afeitar la cabeza del ratón con tijeras. Limpiar la piel del ratón con un hisopo de algodón con clorhexidina al 2% y eliminar todo el vello. Fije el cabezal del ratón en el marco estereotáxico.
Coloque un protector corneal en ambos ojos de ratón, usando un hisopo de algodón. Para prevenir la inducción de estrés en otros roedores, evite la presencia de cualquier otro ratón en la sala de cirugía. Limpie la cabeza del ratón con tres rondas de clorhexidina al 2% seguido de etanol al 70% Exponga el cráneo utilizando material quirúrgico, y haga un orificio delgado con un taladro en coordenadas anteroposteriores de 2,8 mm, y mediolaterales de 1,4 mm, con respecto a la línea medial.
Coloque la aguja de una jeringa de 10 microlitros en el orificio, y mueva la aguja dentro del cerebro lentamente, hasta llegar a 7,2 mm dorsoventral, con respecto a la duramadre. Deje la aguja en la posición final durante dos minutos, para permitir que el tejido se asiente un poco, y luego inyecte un microlitro de vectores virales en la sustancia negra derecha, a una velocidad de 0,2 microlitros cada 30 segundos. Deje la aguja en la misma posición durante cinco minutos después de la administración de vectores virales y luego retírela lentamente.
Cierre la herida con una sutura de seda estéril. Coloque el ratón en la jaula de la casa, precalentado colocándolo sobre un colchón eléctrico caliente. 12 semanas después de la cirugía estereotáxica, evalúe el rendimiento motor, utilizando una versión simplificada de la prueba de haz, descrita anteriormente.
Para este propósito, use una viga horizontal de 25 cm de largo y 3 cm de ancho. La superficie de la viga debe estar cubierta por una rejilla metálica con cuadrados de un centímetro y elevada un centímetro por encima de la viga. Haga un video del ratón, mientras atraviesa el haz de superficie de la rejilla, desde un extremo hasta el extremo opuesto del haz, donde se encuentra la jaula doméstica.
Entrene el ratón durante dos días, antes de la determinación del rendimiento del motor. El primer día, entrena al ratón para que camine a través de la viga cinco veces, sin la rejilla. En el segundo día, entrene al ratón para que camine a través de la viga, en presencia de la rejilla cinco veces.
Al tercer día, evalúe el rendimiento del motor. Para ello, cuantifica el número de errores cometidos, por las patas izquierdas o por las patas derechas por separado, viendo los vídeos en modo cámara lenta. Para anestesiar al ratón, inyecte una mezcla de ketamina y xilazina por vía intraperitoneal.
Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, abra el tórax con material quirúrgico y exponga el corazón. Luego inserte una aguja de punta plana en el ventrículo izquierdo del corazón. Al acoplar la aguja a una tubería, perfunda 50 mililitros de solución salina tampón de fosfato, a una velocidad de 9,5 mililitros por minuto, utilizando una bomba peristáltica.
Retire el cerebro con tijeras y pinzas, y luego fíjelo por inmersión, en cinco mililitros de paraformaldehído al 4%, en solución salina tampón de fosfato. Después, coloque el cerebro fijo, en 15 mililitros de sacarosa al 30% durante 48 horas. Luego coloque el cerebro en cuatro mililitros de solución de crioprotección y guarde el cerebro a 80 grados, o úselo inmediatamente en el siguiente paso.
Para obtener rodajas estriatales, corte el cerebro en secciones de 40 micrómetros de espesor, comenzando en 1.34 mm y terminando en 0.26 mm. Cosecha cada rebanada en un criotubo de dos mililitros, siguiendo el orden anteroposterior. Para realizar análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes en el cuerpo estriado, elija cinco secciones estriatales coronales tomadas a intervalos uniformes, que cubran toda la extensión rostrocaudal del núcleo.
Para validar la correcta entrega de vectores virales en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal, se inyectaron vectores que codifican GFP, en la sustancia negra, y 12 semanas después, se analizaron la fluorescencia GFP y la inmunorreactividad tirosina hidroxilasa en la sustancia negra y estriado por inmunofluorescencia. La fluorescencia asociada a GFP, se localizó exclusivamente en el sitio ipsilateral, y se observó una colocalización significativa con inmunorreactividad tirosina hidroxilasa tanto en la sustancia negra como en el cuerpo estriado, lo que indica la correcta entrega de vectores virales en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal. Para probar la dosis de vectores, que codifica la sinucleína requerida, para inducir una sobreexpresión significativa de sinucleína humana que promueve la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas nigral, se inyectaron diferentes dosis de los vectores.
Y 12 semanas después, la inmunorreactividad de la sinucleína humana y el grado de inmunorreactividad de la tirosina hidroxilasa se probaron en la vía nigrostriatal. La inmunorreactividad de la sinucleína humana fue evidente, con todas las dosis probadas en la sustancia negra. Sin embargo, solo los ratones que recibieron de 10 a los 10 genomas virales por ratón, presentaron inmunorreactividad evidente de la sinucleína humana, en el cuerpo estriado.
Los ratones que recibieron de 10 a los 10 genomas virales por ratón de vectores que codifican la sinucleína humana, mostraron una pérdida significativa de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Aunque los ratones que recibieron la misma dosis de vectores que codifican GFP, mostraron un bajo grado de pérdida neuronal, estos ratones presentaron un grado significativamente menor de neurodegeneración, en comparación con los ratones que recibieron vectores, codificando sinucleína humana. Utilizando la prueba de haz, se detectó una reducción significativa en el rendimiento motor exclusivamente en aquellos ratones, que recibieron de 10 a 10 genomas virales por ratón de vectores que codifican sinucleína humana, al comparar el número de errores cometidos por las patas derecha e izquierda, o al comparar el número total de errores, de ratones que reciben vectores que codifican sinucleína humana, con esos ratones recibiendo el vector de control.
Para definir el inicio de la expresión de sinucleína humana, los ratones fueron tratados con 10 a los 10 genomas virales por ratón, de vectores que codifican sinucleína humana, o cirugía simulada, y se analizó el alcance de la expresión de sinucleína humana en la sustancia negra, una vez a la semana, durante las semanas dos a cinco después de la cirugía estereotáxica. Los resultados muestran que la expresión de sinucleína humana comenzó a ser evidente en la semana cinco después de la cirugía estereotáxica. Para determinar el pico de activación microglial, se cuantificó la extensión de las células que expresan altos niveles de Iba1, en el cuerpo estriado de ratones, durante las semanas 2-15 después de la cirugía.
Los resultados muestran un aumento significativo en la activación microglial del lado ipsilateral, en comparación con el lado contralateral de los ratones, 15 semanas después de la inoculación viral. El número de células T reguladoras infiltradas en la nigra sustancial se analizó en diferentes puntos temporales, después de la cirugía estereotáxica por inmunofluorescencia, seguida de la observación de microscopía confocal. El pico de infiltración de células T reguladoras en la sustancia negra se observó en la semana 11 después de la cirugía.
El modelo de ratón de neurodegeneración analizado aquí, representa un modelo útil para estudiar números de aspectos clave de implicación en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson. Mecanismos de participación implicados en la patología de la sinucleína, la activación microglial, la implicación del sistema inmune periférico, en la neuroinflamación, y los mecanismos de neurodegeneración Una dosis adecuada de vector viral adenoasociado, subtipo cinco que codifica la sinucleína humana para inducir neurodegeneración, neuroinflamación, infiltración de células T y deterioro motor, es de 10 a los 10 genomas virales por ratón. Este estudio muestra, que cinco semanas después de la cirugía estereotáxica, constituye un punto de tiempo clave, en el que la expresión de sinucleína humana ya era evidente, pero en ausencia de deterioro motor en este modelo animal.
Por lo tanto, este punto de tiempo, representa un punto temporal interesante, para iniciar la administración de terapias experimentales adaptadas para detener el progreso de la neuroinflamación y la neurodegeneración. El punto de tiempo más adecuado para analizar la neuroinflamación en este modelo animal, es en la semana 15 después de una cirugía estereotáxica. Mientras que un punto de tiempo adecuado para analizar la infiltración de células T en el sistema nervioso central.
parece estar en la semana 11 después de la inoculación del vector viral.
