トリパノソーマ・クルジまたは他の病原性生物由来のDNAを検出するためのすぐに使用できるqPCR

ゲル化プロトコルは、すぐに使用できるqPCR反応を生成し、実行を開始するために必要な時間とステップを削減します。このプロトコルにより、qPCR反応を一度に生成および制御して品質と量を測定できるため、レシピ計算中またはウェルへの分注中にオペレーターエラーが発生する可能性が低くなります。この方法は、従来の凍結フォーマットですでに完全に最適化されているすべてのqPCRに適用できます。

2つの主要な品質管理ステップが視覚的であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。メレジトース溶液を調製するには、15ミリリットルのプラスチックチューブに4グラムのメレジトースを秤量し、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまで最高速度でボルテックスします。ヌクレアーゼを含まない水で最終容量を10ミリリットルにし、溶液にラベルを付けて摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。

トレハロース溶液を調製するには、15ミリリットルのプラスチックチューブに4グラムのトレハロースを秤量し、粉末が可溶化するまで6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水とボルテックスを最高速度で加えます。次に、ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成し、0.2ミクロンのフィルターで溶液をろ過します。溶液にラベルを付け、摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。

グリコーゲン溶液を調製するには、15ミリリットルのチューブに2グラムのグリコーゲンを秤量し、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまでボルテックスします。グリコーゲンの可溶化により大量の気泡が発生するため、溶液を摂氏2〜8度に8〜12時間保ちます。翌日、インキュベーションから溶液を取り出し、ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成し、標識した溶液を摂氏2〜8度で最大6か月間保存します。

リジン溶液を調製するには、15ミリリットルのチューブに7.5ミリグラムのリジンを量り、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまでボルテックスします。ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成します。溶液を0.2ミクロンのフィルターでろ過し、摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。

ゲル化混合物を調製するには、50ミリリットルのプラスチックチューブに適切な量のストック溶液を混合します。チューブを10回反転させて試薬を混合し、標識した溶液を摂氏2〜8度で最大3か月間保管します。ゲル化用のqPCRマスターミックスを調製するには、冷蔵容器で試薬を解凍します。

次に、1.5ミリリットルのチューブで適切な量の試薬を混合して、8本のチューブストリップまたは96ウェルプレートに十分なマスターミックスを調製します。次にピペット18.5マイクロリットルのゲル化マスターを各反応ウェルに混合し、チューブまたはプレートを真空オーブン内の熱伝導性支持体に入れます。96ウェルプレートを使用する場合は、吸水のために2つの96ウェルプレートごとに1つのベントナイトクレイバッグをオーブンに入れます。

サイクルが完了したら、容量が目に見えて約5マイクロリットルに減少し、チューブまたはプレートを指で叩いても液体が動かないことを確認して、試薬の適切なゲル化についてチューブまたはプレートをチェックします。使用前に、チューブまたはプレートを摂氏2〜8度で8〜12時間密封して保管してください。ゲル化したqPCRを使用するには、チューブストリップまたはプレートを冷蔵庫から取り出し、ワークステーションで開いてサンプル操作を行います。

15マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水と5マイクロリットルのDNAサンプルを各反応容器に加えます。チューブまたはプレートを密封し、目的の実験を実行し、定期的なデータ分析を実行します。現在のプロトコルでは、チャンバー内の温度は摂氏30度で一定に保たれますが、圧力は910〜930ミリバールと真空近くで変化します。

真空サイクルの後、チューブ内のマスターミックスは体積が減少し、底部でゲル化し、チューブを叩いても壁に飛び散ることはありません。ゲル化が不完全な場合、チューブを叩いたときに液体がチューブ壁に飛び散ります。公開されたオリゴヌクレオチド配列を用いたトリパノソーマcruzi-DNA検出をここに示す。

ゲル化が正しく実行されなかったときに同じサンプルを検出すると、感度が低下しました。最も重要なステップは、ゲル化前の試薬量の計算です。水はプロセス中に除去されるため、オペレーターは水を追加しないように注意する必要があります。

プロトコルの手順に厳密に従えば、基本的な実験室および分子生物学のスキルを持つオペレーターは、ゲル化プロセスを実行するのに問題はありません。