Nuestro protocolo permite a los investigadores sondear el metabolismo energético mitocondrial y los esferoides sin fisuras para permitir que se realicen comparaciones entre varias líneas celulares diferentes, números celulares y fenotipos, así como tratamientos farmacológicos en un campo de descubrimiento de fármacos e investigación del cáncer. Nuestro trabajo presenta un protocolo detallado para explorar el metabolismo energético mitocondrial utilizando esferoides 3D que proporcionan el modelo fisiológico superior en comparación con los experimentos de monocapa celular. Las observaciones biológicas podrían extrapolar de un esferoide vítreo a tumores in vivo e identificar vías que pueden dirigirse al metabolismo del tumor esferoide.
Por ejemplo, la utilidad de los carbohidratos durante el crecimiento de los esferoides. Todos los datos del instrumento de flujo extracelular 96 son muy sensibles. El posicionamiento in vitro de los esferoides dentro de la placa de ensayo es primordial para obtener datos precisos a nivel de esferoide único.
Compruebe la viabilidad de los esferoides utilizando un microscopio de luz invertida con contraste de fase a un aumento de 4x para garantizar la estructura esferoide intacta, la morfología y la uniformidad general entre las muestras. Para hidratar el cartucho del sensor, alícuota aproximadamente 20 mililitros del calibrante en un tubo cónico. Coloque el tubo cónico que contiene el calibrante en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche.
Saque el contenido del kit de ensayo. Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad. Pipetear 200 microlitros de agua destilada doble estéril en cada pozo de la placa de servicio utilizando una pipeta P300 multicanal.
Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la placa de utilidad. Compruebe si el nivel de agua en cada pozo es lo suficientemente alto como para sumergir las sondas del sensor. Transfiera el cartucho del sensor ensamblado a una incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono y déjelo durante la noche.
Para recubrir la microplaca de ensayo de esferoides, agregue 30 microlitros de 0,1 miligramos estériles por mililitro de solución de poli-D-lisina por pocillo de microplaca esferoide utilizando una técnica séptica. Aspire la solución de cada pocillo de la microplaca esferoide, invierta la placa y tóquela firmemente sobre papel de seda para eliminar cualquier solución residual. Lavar cada pocillo de la placa con 200 microlitros de agua estéril doble destilada.
Después del lavado final, invierta la microplaca y cúbrala firmemente sobre papel de seda para eliminar el agua residual. Deje que la placa se seque al aire durante 30 minutos antes de su uso futuro. Prepare el medio XF RPMI como se describe en el manuscrito.
Precalentar el medio de ensayo XF RPMI suplementado a 37 grados Celsius una hora antes del ensayo. Y precalentar la microplaca de ensayo de esferoides recubiertos en una incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono. Saque el tubo cónico que contiene el calibrante y el cartucho del sensor de la incubadora de aire.
Retire el cartucho del sensor de la placa de utilidad y colóquelo boca abajo en la superficie de trabajo. Usando una pipeta multicanal P300, aspire el agua de la placa de servicio y deséchela. Agregue 200 microlitros del calibrante precalentado a cada pozo de la placa de utilidad.
Coloque el cartucho del sensor en la placa de utilidad asegurándose de que los sensores estén bien sumergidos en el calibrante. Transfiera el cartucho del sensor ensamblado a la incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono hasta que esté listo para cargar las soluciones de inyección de puerto. Saque la placa de cultivo de esferoides de la incubadora y observe los esferoides bajo el microscopio para garantizar su integridad antes de los pasos de transferencia de esferoides.
Cargue 180 microlitros de medio de ensayo precalentado en cada pozo de la placa esferoide, incluidos los pozos de corrección de fondo. Llene parcialmente una placa de Petri de siete centímetros con tres mililitros del medio de ensayo. Transfiera los esferoides de la placa de cultivo de 96 pozos a una placa de Petri, utilizando una pipeta multicanal cargada con puntas de pipeta de orificio ancho y un volumen ajustado a 10 a 50 microlitros.
Ajuste el volumen de un pipeteador de un solo canal equipado con una punta de pipeta de orificio ancho a 20 microlitros y aspire cuidadosamente un solo esferoide. Coloque la punta directamente en el centro de cada pozo de esta microplaca de ensayo de esferoides y permita que la acción capilar retire el esferoide de la punta de la pipeta. Confirme la evolución bajo el microscopio mediante el pipeteo del contenido del pipeteador en la placa de Petri.
Una vez que todos estos esferoides se hayan transferido a la microplaca de ensayo de esferoides, transfiera la placa a una incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante un mínimo de una hora. Prepare las concentraciones de material de trabajo de cada compuesto como se describe en el manuscrito, utilizando un medio de ensayo XF RPMI precalentado completamente complementado. Dispensó 20 microlitros de la solución de trabajo de cada compuesto en todos los puertos correspondientes utilizando una pipeta multicanal P100 calibrada.
Prepare el analizador para cargar el cartucho del sensor. Para obtener esferoides compactos bien formados, cada línea celular se optimizó individualmente para la densidad de siembra y la duración del cultivo. En las estrategias de siembra optimizadas, el volumen de esferoides para SK-OV-3 fue de alrededor de 5,46 x 10 a los siete micrómetros cúbicos en cubos y para A549, fue de 1,45 x 10 a ocho micrómetros cúbicos.
Todos los tipos de esferoides tenían una correlación lineal entre la densidad de siembra inicial y el volumen esferoide. La simetría esferoide perfecta tenía una circularidad de 1.0 y una desviación de 1.0 indicaba una pérdida de circularidad. Para todos los tipos de esferoides, la tasa de consumo de oxígeno aumentó con el tamaño de los esferoides y se correlacionó linealmente con el volumen de esferoides con el más alto en los esferoides MCF-7 y el más bajo en los esferoides SK-OV-3.
Los esferoides MCF-7 no respondieron al control del vehículo durante todo el experimento. La tasa de consumo de oxígeno en los esferoides MCF-7 se redujo con oligomicina después de cinco ciclos de medición después de la primera inyección de 0,5 microgramos por mililitro. En respuesta a BAM15, la tasa de consumo de oxígeno aumentó antes de la segunda inyección.
Mientras que la combinación de rotenona más antimicina A lo redujo. Un protocolo para sondear con precisión la respiración mitocondrial basal. La respiración por fosforilación de ADP, la respiración por fugas, la eficiencia de acoplamiento, la capacidad respiratoria máxima y la capacidad respiratoria sobrante se desarrollaron utilizando esferoides 3D derivados del cáncer.
Todos los compuestos respiratorios produjeron los perfiles de tasa de consumo de oxígeno cinético esperado para los compuestos seleccionados, revelando una tasa de respiración basal constante promedio de 20 a 30 picomoles de oxígeno por minuto, por pozo. Ubicación de los esferoides dentro de la microplaca y número de ciclo de medición después de la inyección del compuesto para garantizar que las tasas de respiración sean estables entre las adiciones de compuestos. Al explorar la capacidad respiratoria mitocondrial con desacopladores, no solo la concentración es clave, sino también su capacidad para desacoplar la respiración en presencia de oligomicina, que generalmente se agrega antes que el desacoplador en experimentos que investigan el metabolismo energético mitocondrial.
