Durante la hematopoyesis, las células madre hematopoyéticas experimentan un cambio metabólico de la glucólisis a la fosforilación oxidativa. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones glucolíticas y mitocondriales de las células madre y progenitoras hematopoyéticas de ratón. Este método se puede utilizar para evaluar la bioenergética celular en tiempo real.
La plataforma basada en microplacas de 96 pocillos ofrece una cuantificación de alto rendimiento con alta sensibilidad, lo que permite el análisis simultáneo de múltiples muestras utilizando una sola placa. Esta técnica se puede utilizar para sondear los efectos de los productos químicos o las manipulaciones genéticas en el metabolismo de HSC en condiciones variadas. Puede ayudar a dilucidar las vías metabólicas que sostienen la pluripotencia de HSC.
Aunque el estudio actual se centra principalmente en tallos hematopoyéticos de ratón y células progenitoras, el protocolo y este enfoque podrían adaptarse fácilmente para optimizar las condiciones de análisis para cualquier tipo de células en suspensión. Un día antes del ensayo, abra el kit de ensayo de flujo extracelular para extraer el cartucho del sensor y el conjunto de la placa de utilidad. Guarde los planos de la guía de carga para usarlos al día siguiente.
Ahora separe manualmente el cartucho del sensor de la placa de utilidad y colóquelo boca abajo junto a la placa de utilidad. Usando una pipeta multicanal, llene cada pozo de la placa de utilidad con 200 microlitros de calibrante incluidos con el kit de ensayo de flujo, luego coloque el cartucho del sensor nuevamente en la placa de servicio, asegurándose de sumergir completamente los sensores en el calibrante. Luego incube la placa de utilidad con el calibrante y el cartucho del sensor ensamblado en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche siguiendo las condiciones de humidificación mencionadas en el manuscrito.
El día del ensayo, prepare 2,5 mililitros de la solución adhesiva celular por microplaca de cultivo celular de 96 pocillos como se describe en el manuscrito de texto. Abra la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos incluida con el kit de ensayo de flujo y dispense 25 microlitros de la solución adhesiva celular preparada en el fondo de cada pozo. Cubra la microplaca con la tapa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de la campana.
Después de la incubación, retire y deseche el exceso de solución adhesiva celular con una pipeta o aspirador multicanal y lave cada pozo dos veces con 200 microlitros de agua ultrapura estéril. Seque al aire la placa sin la tapa dentro de la campana durante 30 a 45 minutos. Centrifugar los HSPC negativos de linaje de ratón preparados a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en el medio de ensayo apropiado y vuelva a centrifugar la suspensión celular. Repita este procedimiento una vez más y vuelva a suspender las células en el medio de ensayo calentado apropiado a la concentración de 250, 000 células por 50 microlitros o cinco millones de células por mililitros. Use una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros de la suspensión celular a lo largo del lado de cada pocillo de la microplaca de cultivo celular recubierta de 96 pocillos con adhesivo celular, luego agregue 50 microlitros del medio de ensayo en los pozos de medición de fondo de esquina.
Cree una placa de equilibrio de centrífuga agregando 50 microlitros de agua por pozo de una microplaca de cultivo celular de 96 pocillos sin recubrimiento. Centrifugar las células a 200 veces G durante un minuto a temperatura ambiente. Incubar la placa en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 25 a 30 minutos para la fijación celular.
Después de 30 minutos, confirme visualmente bajo un microscopio que las células están adheridas de manera estable a la superficie de la microplaca. Comience por preparar todas las soluciones requeridas en el medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis precalentado como se menciona en el manuscrito de texto y retire el cartucho del sensor hidratado de la incubadora. Levante el cartucho del sensor del calibrante y reemplácelo en la misma placa de utilidad con el calibrante para eliminar las burbujas de aire.
Coloque la guía de carga 80 plana en la parte superior del cartucho del sensor orientándola de modo que la letra A se encuentre en la esquina superior izquierda. Usando una pipeta multicanal, dispense 20 microlitros de solución de glucosa de 100 milimolares en el puerto A.Reemplace la guía de carga 80 plana con la guía de carga BC plana, orientando la letra B en la esquina superior izquierda. Dispense 22 microlitros de solución de oligomicina micromolar de 20 en el puerto B.Reoriente la guía de carga BC plana para ubicar la letra C en la esquina superior izquierda para cargar el puerto C y dispense 25 microlitros de solución 2-desoxi-d-glucosa milimolar 500 en el puerto C.Luego retire y deseche los planos de guía de carga.
Ahora cree o cargue la plantilla para la prueba de esfuerzo de glucólisis en el controlador. Ingrese los detalles sobre las estrategias de inyección, las condiciones de tratamiento y los tipos de células, y presione Generar grupos. Vaya al mapa de placas y asigne pozos a cada grupo a analizar.
En el protocolo, asegúrese de que la calibración y el equilibrio se comprueban en el paso de inicialización. Para la medición de referencia y las mediciones después de cada inyección, establezca el número de ciclos de medición en tres y mezcle, espere, mida los tiempos a tres minutos, cero minutos, tres minutos. Haga clic en Iniciar ejecución en el software.
Retire la tapa del cartucho sensor de compuestos cargado e hidratado y colóquela en la bandeja de trabajo del analizador de flujo extracelular. Comience la ejecución de calibración. Saque la microplaca que contiene las células sembradas de la incubadora.
Sin perturbar las células, agregue lentamente 130 microlitros del medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis precalentado por pozo para compensar el volumen medio en cada pozo a 180 microlitros y devuelva la placa a la incubadora durante 15 a 20 minutos adicionales. Haga clic en Abrir bandeja en el software para abrir la bandeja térmica de Seahorse. Una vez finalizada la calibración, reemplace la placa de utilidad con esta microplaca de ensayo que contiene las celdas y presione la placa de la celda de carga para iniciar las mediciones.
Una vez finalizadas las mediciones, retire el medio de ensayo de la placa sin perturbar las células y lávelas suavemente con 250 microlitros de solución salina tamponada con fosfato sin desalojar las células. Ahora agregue 10 microlitros de tampón de lisis de radioinmunoprecipitación suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa 1X a cada pocillo y agite la placa en un agitador durante 10 minutos. Congele toda la placa a menos 80 grados centígrados.
Descongele la placa y realice un ensayo de medición de proteínas para la normalización de datos siguiendo las instrucciones del fabricante. Recupere y analice los datos abriendo el archivo de datos utilizando el software de escritorio Wave. Haga clic en Normalizar, pegue los valores de normalización para cada pozo y luego haga clic en Aplicar para normalizar los datos.
Haga clic en Exportar y seleccione el generador de informes de prueba de esfuerzo de glucólisis para exportar los datos analizados a un generador de informes. La tasa de acidificación no glicolítica aumenta con el aumento del número de células de 50, 000 a 250, 000, pero aumenta solo mínimamente entre 200, 000 a 250, 000. La inyección de glucosa 10 milimolares estimula la glucólisis en todos los números celulares con un aumento máximo de ECAR observado en 250, 000 células por pozo.
Sin embargo, la inyección de dos micromolares de oligomicina no aumenta aún más el ECAR. Los datos de OCR obtenidos en el mismo conjunto de pruebas de esfuerzo de glucólisis muestran una caída significativa después de la inyección de oligomicina debido a la inhibición del complejo 5. Se calcularon los parámetros de la prueba de esfuerzo de glucólisis y se seleccionaron 250.000 células por pozo en dos micromolares de oligomicina para estudios adicionales.
La prueba de esfuerzo mitocondrial mostró que dos inyecciones micromolares de oligomicina causan una reducción significativa en la OCR a través de la inhibición del complejo 5. FCCP estimula el OCR en HSPC de una manera dependiente de la dosis con un aumento máximo observado en dos micromolares. Una mezcla de 0,5 micromolares rotenona y 0,5 micromolares antimicina A inyectables disminuye el OCR a su nivel mínimo correspondiente al consumo de oxígeno no mitocondrial.
Se calcularon los parámetros de la prueba de esfuerzo mitocondrial y se seleccionaron dos micromolares de FCCP para estudios adicionales. Dada la naturaleza de alto rendimiento de esta técnica, el protocolo descrito aquí podría adaptarse fácilmente para detectar un gran número de moduladores bioenergéticos en células madre hematopoyéticas, progenitores hematopoyéticos y células hematopoyéticas malignas. El análisis de caballitos de mar es ampliamente utilizado en la literatura para medir el metabolismo en una amplia variedad de contextos en presencia de diversos sustratos e inhibidores.
