Este método puede ayudar a responder preguntas clave como cómo el metabolismo energético en el tejido de la retina difiere entre las muestras biológicas, o después de la exposición a agentes farmacológicos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza tejido organotípico de la retina explantado para medir las tasas de glucólisis, y fosforilación oxidada y permite evaluaciones de intervenciones en tiempo real in vitro. Para calibrar la instrumentación para un ensayo de flujo extracelular, agregue primero un mililitro de solución de calibración a cada pozo del cartucho del sensor de 24 pozos, e incubar a 37 grados celsius en una incubadora libre de Co2 durante la noche.
Aditivos de carga para el protocolo de tensión mitocondrial, o el protocolo de glucólisis en cada puerto del inyector en el cartucho del sensor, ajustando para los cambios de volumen en el pozo. Suponiendo un volumen inicial de 450 microlitros, un ensayo típico incluiría 45 microlitros de un aditivo en el primer puerto del inyector, 49,5 microlitros en el segundo, 54,5 microlitros en el tercero y 60 microlitros hasta el último. Durante los primeros experimentos, cargue el medio base en el puerto A para medir cuánto artefacto de movimiento de tejido se produce después de una inyección de puerto.
Deje que la placa del sensor cargada se incuba a 37 grados celsius en una incubadora no co2 durante al menos 60 minutos. Comience el aislamiento del tejido fresco de la retina del ratón con un ratón recién eutanizado. Usa un par de fórceps curvados de tamaño medio para agarrar el globo posterior en el nervio óptico, y aplica suavemente presión hacia adelante para proptizar el ojo.
Con una cuchilla de afeitar limpia, crea una incisión de limbo a limbo a través de la córnea usando una sola pasada deliberada de la hoja. Usando fórceps de estilo McPherson en ángulo fino, pellizca el globo posterior para expresar la lente y las membranas hiloide anteriores fuera de la incisión corneal. Repita la maniobra de pellizcar con fórceps para expresar la retina neural.
Luego, usa los fórceps como una cuchara para levantar la retina lejos de la incisión corneal. Coloque la retina directamente en el medio caliente en una placa de tres centímetros, o una placa de racimo de cultivo de tejido de seis bien. A continuación, usa dos pares de fórceps de estilo de McPherson en ángulo fino para diseccionar suavemente el vítreo restante de la retina.
Esto se hace mejor agarrando el vítreo en la periferia de la copa de la retina, y tirando hacia el centro, con una desinserción final del cuerpo vítreo desde el centro en su conjunto. Luego, retire cualquier epitelio pigmentario de retina residual de la superficie del foto receptor de la retina. Corte una punta de pipeta P1000 con una cuchilla de afeitar para crear una abertura aproximada de cuatro milímetros para evitar traumatismos indebidos en el delicado tejido de la retina durante las maniobras de transferencia.
Luego, utilice la punta de la pipeta cortada para transferir el tejido de la retina aislado a un medio fresco. Por último, usa un punzón de biopsia de un milímetro equipado con un émbolo, para cortar punzones de retina alrededor del nervio óptico. Deje los punzones de retina a un lado en medio limpio, mantenido en un bloque Celsius de 37 grados, o almohadilla de calentamiento.
Una vez que se haya recogido el número deseado de punzones, utilice la linda punta P1000 para aspirar un golpe individual en 450 microlitros de medio, y transferirlo a una micro placa de captura de ojal de 24 pozos en una almohadilla de calor de 37 grados Celsius o bloque de calor. Utilice fórceps finos y rectos para manipular suavemente los golpes en el centro de la micro placa. Mantenga los golpes orientados en la misma dirección.
Por ejemplo, con el lado de la célula ganglionar hacia arriba. Para cada experimento reserva de tres a cuatro pozos en blanco con 450 microlitros de medio base para servir como controles negativos. Mientras evita las burbujas de aire o el movimiento excesivo, coloque suavemente las inserciones de malla de captura del ojal en cada pozo y fije las plaquitas con un émbolo metálico o con una punta de pipeta P1000 cortada.
Aunque la microcámara tiene una profundidad adecuada para acomodar la retina típica del ratón, ocasionalmente los defectos de la máquina en las inserciones de malla hacen que los tejidos se comprimen excesivamente durante la inserción de la pantalla. Si esto sucede, simplemente tome nota de este tejido triturado y excluya esa muestra del análisis final. Incubar la placa de tejido en una incubadora libre de dióxido de carbono de 37 grados Celsius durante al menos 60 minutos.
Programe el analizador de flujo celular adicional utilizando los comandos mix, weight, measure y repeat. Por ejemplo, un experimento típico con tejido retinal puede incluir lo siguiente. Mezcle dos minutos, espere dos minutos y mida cinco minutos.
Repita el experimento con estos tres pasos entre cinco y ocho veces para el registro de la línea base y después de la inyección de cada compuesto que se está probando. Pulse el botón de inicio del programa en el analizador de flujo extracelular y siga las instrucciones de la pantalla para insertar el cartucho del sensor para la calibración. Al final de la calibración, siga las instrucciones de la pantalla para reemplazar la placa calibradora por la placa que contiene las muestras de retina y, a continuación, permita que el programa funcione según lo programado.
Al finalizar la carrera, siga las instrucciones de la pantalla para expulsar la placa de tejido. Vea los resultados de la ejecución y almacene el archivo de datos. Con una aguja de calibre 20 doblado y fórceps, retire todas las inserciones de malla de los pozos, dejando el punzón de la retina detrás.
Aspirar cuidadosamente el medio del tejido y lavar el tejido dos veces con 0,5 mililitros de solución salina tamponada de fosfato frío. Después de aspirar el segundo lavado PBS, agregue 100 microlitros de tampón de lysis a cada lavado, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar el tejido. Por último, cuantifica los niveles de entrada basados en el contenido total de ADN de doble cadena diluyendo las muestras de un a uno, con 100 microlitros de tampón Tris-EDTA, y transfiriendo 100 microlitros de la muestra diluida a una placa de 96 pozos diluida.
A continuación, agregue 100 microlitros de búfer de detección a cada pozo y mezcle durante dos a cinco minutos. Por último, cuantifica la florescencia después de la excitación a 480 nanómetros y la emisión a 520 nanómetros en comparación con una curva estándar. Normalizar el rastreo de flujo extracelular crudo al contenido de ADN dentro del pozo.
En la línea base, en presencia de glucosa de cinco mil montantes y en presencia de piruvato de 10 milivas, no hay diferencias significativas en las tasas de eflux ácido, medida por la tasa de acidificación extracelular. Entre los tejidos de la retina de los animales de tipo wile, o noquear a los ratones que carecen de la maquinaria para cerrar los canales de iones cerrados de nucleótidos cíclicos en respuesta a los estímulos de luz. Patrones similares se observan después de la adición de 20 mil muller glucosa y el inhibidor glucolítico 2DG.
Estos datos pueden transformarse matemáticamente para representar cambios fraccionarios desde la línea de base, un formato que puede permitir una mejor comparación entre diferentes intervenciones experimentales. La tasa de consumo absoluto de oxígeno al inicio también es equivalente entre el control y el tejido de la retina mutante. La adición de glucosa de 20 mil mil muller aumenta la respiración mitocondrial, pero no hay cambios en los observados entre los grupos en términos de cuantificación absoluta o en términos de cambio desde el inicio.
La adición de un mili muller FCCP, un agente de desacoplamiento, para demostrar las tasas respiratorias mitocondriales máximas no aumenta significativamente el OCR por encima del nivel observado con alta glucosa en control y tejido de retina mutante. Sin embargo, las señales de ambos ratones caen drásticamente después de la adición del cóctel RAA. En conclusión, demostramos una técnica para cuantificar las tasas de fosforilación oxidada y glucólisis en explantes organotípicos de la retina del ratón.
Con un aislamiento eficiente del tejido de la retina, la técnica produce mediciones fiables y repetibles. Se pueden evaluar los efectos en tiempo real de las exposiciones, como los agentes de desacoplamiento. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el RTPCR cuantitativo y la hinchazón occidental, en el tejido sobrante aislado en el paso de disección para obtener información paralela relevante para estudios del metabolismo de la retina.
