El método que demostraremos hoy proporciona una solución de alto rendimiento para evaluar la seroconversión de anticuerpos asociados con infecciones por COVID-19 o la vacunación para análisis de rutina. Curiosamente, este enfoque nos permite evaluar múltiples epítopos en el mismo analito. Esto tiene numerosas aplicaciones en las ciencias biológicas, incluidos los estudios de señalización celular y el monitoreo de las respuestas inmunes.
Demostrando esta técnica para usted hoy estará el Dr. Imad Tarhoni, un becario postdoctoral en mi laboratorio. Para comenzar, seleccione tres viales diferentes de las microesferas magnéticas con regiones de cuentas únicas y registre la identificación de la cuenta y la información del lote para cada vial utilizado. Luego, vórtice el stock de microesfera seleccionado durante 60 segundos y sonice durante cinco minutos.
Transfiera 1.0 veces 10 a las seis perlas a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1.5 mililitros e inserte el tubo en un separador magnético. para permitir la separación durante 60 segundos. Con el tubo todavía en el separador magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante sin molestar la bolita de perlas.
Retire el tubo del separador magnético y, a continuación, vuelva a suspender las perlas con 100 microlitros de agua y vórtice de grado HPLC durante 30 segundos. Nuevamente, coloque el tubo nuevamente en el separador magnético durante 60 segundos y posteriormente retire el sobrenadante. Repita el protocolo de lavado dos veces.
Después del último lavado, retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las microesferas lavadas en 90 microlitros de tampón de activación, pH 6.2, por vórtice durante 30 segundos. A continuación, trate secuencialmente las microesferas con 10 microlitros de 50 miligramos por mililitro de anhidroxi-sulfosuccinamida y 10 microlitros de 50 miligramos por mililitro de solución de EDC por vórtice durante 10 segundos. Más tarde, incuba las microesferas durante 20 minutos a temperatura ambiente con un vórtice suave cada 10 minutos.
Después de la incubación, lave las microesferas dos veces con MES de 50 milimolares o tampón de acoplamiento, pH 5.0, como se describió anteriormente. Repita el lavado dos veces. Una vez hecho esto, retire el tubo del separador magnético y vuelva a suspender las perlas con 100 microlitros de tampón de acoplamiento por vórtice durante 30 segundos, seguido inmediatamente de agregar la cantidad deseada de proteína al tubo.
Lleve el volumen total a 150 microlitros con tampón de acoplamiento y mezcle la reacción por vórtice durante 30 segundos. Luego, incuba el tubo durante dos horas por rotación a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las microesferas dos veces con el tampón de enfriamiento PBS y resuspenda las microesferas lavadas en 100 microlitros de tampón de enfriamiento que contengan 0.05% de azida de sodio por vórtice durante 30 segundos.
Cuente el número de microesferas recuperadas utilizando un contador celular automatizado y registre la concentración de cuentas observada. Para el rendimiento del ensayo, resuspender las microesferas acopladas por vórtice durante 30 segundos y sonicar durante 60 a 90 segundos. Luego, retire la cantidad requerida de cada coloide de cuentas del tubo respectivo y combine los coloides de cuentas en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.
A continuación, inserte el tubo en un separador magnético y permita la separación durante 60 segundos. Con el tubo todavía en el separador magnético, retire el sobrenadante sin molestar la bolita de perlas. Después de retirar las perlas del separador, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de ensayo.
Vórtice durante 30 segundos antes de colocar el tubo en un separador magnético durante 60 segundos para separar las perlas. Repita el lavado dos veces. A continuación, ajuste la concentración de la mezcla de microesferas de trabajo de tres plexos agregando un volumen apropiado de tampón de ensayo para generar una concentración final de 100 microesferas por un microlitro para cada objetivo.
Alícuota 25 microlitros de la mezcla de microesferas en cada pozo de una placa de 96 pocillos. Diluya las muestras de plasma o suero 500 veces en tampón de ensayo y prepare muestras estándar de acuerdo con la titulación deseada. Agregue 25 microlitros de tampón de ensayo como muestra en blanco y agregue cada uno de los especímenes diluidos o estándar en cada pozo designado de una placa de muestra de 96 pocillos.
Cuando haya terminado, cubra la placa con un sello o papel de aluminio para incubar durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placas ajustado a 700 rotaciones por minuto. Preparar una solución de anticuerpos de detección antihumanos o soluciones de anticuerpos secundarios a cuatro microgramos por microlitro con tampón de ensayo como se describe en el manuscrito. Coloque la placa en un separador magnético para lavarla rápidamente y luego invierta la placa con fuerza sobre un recipiente de riesgo biológico para eliminar el líquido de los pozos.
Con la placa aún invertida, golpee con fuerza la placa contra un fajo grueso de papel. Luego, lave cada pozo con 100 microlitros de tampón de ensayo y retire el líquido mediante una inversión forzada sobre un recipiente de riesgo biológico. Repita el lavado dos veces.
Después del último lavado, deseche todos los fajos de papel usados en un recipiente de riesgo biológico. A continuación, agregue 25 microlitros de solución secundaria de trabajo de anticuerpos a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y cubra la placa con papel de aluminio para incubar en un agitador de placas a 700 rotaciones por minuto. Después de 30 minutos de incubación, lave los pocillos de la placa dos veces con un tampón de ensayo como se demostró anteriormente.
Luego, agregue 100 microlitros de tampón de ensayo en cada pozo de la placa de 96 pocillos. Cubra la placa con papel de aluminio e incube durante cinco minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente. Analice una muestra de 60 microlitros a través del analizador de instrumentos de acuerdo con el manual del sistema.
Para optimizar el tiempo de incubación de la captura de muestras, incube las placas durante una duración de 30, 60 y 120 minutos. Después de la incubación, analice 60 microlitros de la mezcla de ensayo en el analizador. Se evaluó una curva estándar de siete puntos basada en una serie de dilución en serie de 1:5 para el pico S1, los anticuerpos de membrana y la nucleocápside.
La prueba de precisión intra-ensayo se realizó en la placa para evaluar la precisión del ensayo calculada como porcentaje de coeficiente de variación, desviación estándar y promedio. Para la precisión entre ensayos, se prepararon tres lotes distintos de los juegos de cuentas para cada ensayo. Se calcularon las variables de precisión del ensayo con las muestras estándar y de plasma humano.
Los valores medios de intensidad fluorescente promedio a los 120 minutos de la incubación fueron óptimos para los títulos de IgG para el pico S1, la membrana y los anticuerpos de la nucleocápside, lo que indica una cinética de unión primaria rápida de anticuerpos. Las optimizaciones de la concentración secundaria de anticuerpos en el rendimiento de doble canal demostraron una amplia gama de señales en la medición lineal para todas las concentraciones. Las señales observadas de diferentes incubaciones temporales de los anticuerpos secundarios y los detalles sobre los cambios de señal para todos los tiempos de incubación se muestran aquí.
En las evaluaciones de especificidad para los ensayos de doble canal, se observó una contaminación insignificante de la señal cruzada entre el canal en blanco y el canal de un solo informador. En la ilustración de los eventos de seroconversión después de la vacunación contra covid 19, los valores de Pico S1 IgA e IgM observados fueron aproximadamente 40 veces más bajos que los títulos de isotipo igG. Este método tiene implicaciones importantes para el monitoreo de la respuesta a las vacunas en individuos inmunocomprometidos.
Nos permitirá determinar si estos pacientes realmente están siendo protegidos por esas vacunas.
