Nuestro protocolo abre nuevas posibilidades para investigar cómo se produce la replicación en el ADN dañado. Las técnicas pueden detectar la formación y reparación de huecos de ADN monocatenario, opuestos a la lesión de ADN. La nucleasa S1 escinde el ADN monocatenario y permite la detección de huecos post-replicativos.
Este enfoque fue utilizado por primera vez por el Dr. Meneghini y el Dr. Cordiero-Stone en la década de 1970 en Brasil, y recientemente adaptado por nosotros al ensayo de fibra de ADN. El uso de la técnica descrita aquí para estudiar la formación y reparación de brechas post-replicativas puede proporcionar información sobre el mecanismo de reparación del ADN y la respuesta al estrés de replicación que mantienen la integridad del genoma. Para los dos protocolos descritos aquí, la fibra S1 y los ensayos de llenado de huecos, es crucial incluir todos los controles para garantizar una interpretación precisa de los datos.
El procedimiento será demostrado por Davi J.Martins, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, y la Dra. Annabel Quinet, una colaboradora que previamente desarrolló estas técnicas cuando trabajaba en nuestro grupo. Para empezar, aspire los medios de cultivo e inmediatamente agregue los medios de cultivo con 20 micromolares de medios IDU a las células. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante exactamente 20 minutos.
Luego, lave rápidamente las células con PBS precalentado dos veces e irradie con 20 julios por metro cuadrado UV-C. Utilice células no tratadas como controles. Agregue inmediatamente los medios con CldU 200 micromolares a las células e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante exactamente 60 minutos.
Después de eso, lave las células con PBS precalentado dos veces y permeabilice con el tampón CSK 100 durante dos a 10 minutos de acuerdo con la línea celular a temperatura ambiente. Después de la permeabilización de CSK, los núcleos casi sin citoplasma se pueden ver en comparación con los anteriores a la permeabilización. Vierta cuidadosamente PBS por el costado de cada pozo para lavar los núcleos con PBS.
Luego, lave los núcleos con el tampón S1. Incubar los núcleos en el tampón S1 con 20 unidades por mililitro de nucleasa S1, y sin la nucleasa S1, durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, aspire el búfer S1 y agregue 0.1% BSA en PBS.
Raspe los núcleos y transfiéralos a un tubo de aproximadamente 1,5 mililitros anotado. Mantenga los tubos en hielo todo el tiempo. Centrifugar los núcleos a alrededor de 4, 600 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Resuspendir los gránulos en PBS a una concentración de aproximadamente 1.500 células por microlitro. Coloque los tubos sobre hielo e inmediatamente proceda a la preparación de la fibra de ADN mediante la propagación del protocolo. Anote los portaobjetos del microscopio con un lápiz de carbón y colóquelos planos en una bandeja.
Toque la parte inferior del tubo para asegurar la homogeneización y agregue dos microlitros de celdas en la parte superior de la diapositiva correspondiente. Agregue seis microlitros del tampón de lisis y lisa las células mediante la canalización hacia arriba y hacia abajo unas cinco veces. Use la punta de la pipeta para tirar de la gota ligeramente hacia la parte inferior del portaobjetos e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para lisar los núcleos.
Incline la diapositiva a unos 20 a 40 grados y permita que la caída se extienda a la parte inferior de la diapositiva a una velocidad baja constante. Deje que el tobogán se seque a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 a 15 minutos. Luego, sumérjalos en un frasco que contenga la solución de fijación recién preparada e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para fijar el ADN en los portaobjetos.
Lave los portaobjetos con PBS dos veces durante cinco minutos y desnaturalice el ADN con ácido cloridrico 2.5 molares recién preparado durante 40 a 60 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos con PBS tres veces durante cinco minutos y bloquee con 5% BSA previamente calentado durante 30 a 60 minutos a 37 grados centígrados. Toque suavemente el papel para eliminar el exceso de líquido de las diapositivas.
Agregue 30 microlitros de anticuerpos primarios a las diapositivas hacia abajo y coloque un resbalón de cubierta en la parte superior. Incubar durante 1 a 1,5 horas a temperatura ambiente en una cámara oscura y húmeda. Coloque las diapositivas en un frasco con PBS durante uno o dos minutos y luego retire cuidadosamente los resbalones de la cubierta.
Lavar con PBST en un frasco tres veces durante cinco minutos y colocar los portaobjetos en PBS. Retire el exceso de líquido golpeando suavemente un papel y agregue 30 microlitros de los anticuerpos secundarios a las diapositivas hacia abajo. Coloque un resbalón de cubierta en la parte superior.
Incubar durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente en una cámara oscura y húmeda. Repita los pasos para lavar las diapositivas y eliminar el exceso de PBS una vez más y agregue 20 microlitros del reactivo de montaje en forma de gota a las diapositivas. Coloque un resbalón de cubierta en la parte superior y evite las burbujas.
Coloque una gota de aceite de inmersión cerca de la parte superior del tobogán donde se lisaron las células. Usa el canal verde y busca los puntos verdes en el fondo para encontrar el foco. Abra el software Leica Application Suite, haga clic en Adquirir y seleccione el canal verde.
Ajuste la configuración del canal verde antes del análisis. Luego, cambie al canal rojo y ajuste la configuración. Encuentre la concentración principal de fibras y muévase a los bordes para encontrar las fibras individuales bien distribuidas, no superpuestas.
Utilice solo un canal para seleccionar las regiones de las imágenes y evitar posibles sesgos. Haga clic en el icono Adquirir superposición y ajuste el software para obtener el aumento correcto del microscopio. Tome alrededor de 15 a 20 imágenes por diapositiva junto con toda la diapositiva en el canal verde y luego en el canal rojo.
Los dos canales ahora se fusionan y la superposición creada se mueve a una carpeta única. Es posible ver las fibras con colores rojo y verde. Abra el software ImageJ, haga clic izquierdo en el quinto icono, seleccione la segunda opción y luego seleccione la herramienta Línea segmentada.
Haga clic con el botón izquierdo para dibujar la ruta exacta del tracto rojo o verde y haga clic con el botón derecho para detener el dibujo. Presione el botón M en el teclado para medir la longitud. Para la fibra S1, realice un seguimiento de las mediciones de los tractos rojo y verde para cada fibra y mida las longitudes de tracto rojo y verde de al menos 150 fibras de diferentes imágenes.
Una fibra S1 se muestra en estas imágenes representativas. El tracto de ADN naciente de control sin los huecos e impermeable a la escisión por la nucleasa S1 se muestra aquí. El tracto de ADN positivo para los huecos escindidos por la nucleasa S1 resultó en una longitud del tracto CldU más corta.
Se puede realizar un esquema de etiquetado diferencial ampliamente descrito en el manuscrito de texto para etiquetar eventos que llenan vacíos. En este ensayo, denominado ensayo de llenado de huecos, las pistas IDU más largas con al menos un parche CldU o menos parches CldU se corresponden con una baja densidad de llenado de huecos. Los tractos IDU más cortos, con al menos un parche CldU, y los tractos IDU más largos con más parches CldU, se corresponden con una alta densidad de llenado de huecos.
El paso de permeabilización de este protocolo es crucial para que la nucleasa S1 actúe sobre los huecos formados durante la replicación del ADN dañado. La nucleasa S1 también se puede utilizar en el protocolo de ensayo de cometas para detectar los huecos formados durante la replicación del ADN dañado que persiste después del tratamiento. El ensayo de fibra S1 allanó el camino para el nuevo paradigma de que las brechas post-replicativas pueden causar vulnerabilidad al cáncer, particularmente en cánceres de mama y ovario portadores de mutaciones en los genes BRCA1 y 2.
