Se agradece al Dr. T. Helleday y el Dr. E. Petermann para ayudar con la técnica de fibra, así como los miembros del laboratorio útil para el debate. WN con el apoyo de una Beca de Investigación Internacional Senior de la Asociación para la Investigación Internacional del Cáncer y por el Comité de Estado polaco de Investigación Científica de subvención (165.935 N301).

El método descrito aquí se utilizó en la siguiente publicación: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 de cultivo celular Materiales: suero fetal bovino (FBS), suero de pollo, la penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI <ol><li> Preparar el medio de cultivo celular: añadir el 7% de SFB, el 3% suero de pollo, la penicilina 1x / estreptomicina y 10 mM 2-mercaptoetanol al medio RPMI. </li><li> DT40 células se cultivan en frascos de cultivo celular estéril a 38 ° C y 5% de CO 2 en un incubador humidificado. Dividir celdas cada día a una densidad de 5 x 10 5 células / ml 6. </li></ol> 2. En vivo etiquetado Materiales: UDI, CldU <ol><li> Preparar soluciones madre de los análogos de nucleótidos: disolver UDI a 5 mm y CldU a 2,5 mm de media. Calentar las soluciones brevemente a 60 ° C y agitar hasta que el análogo de los nucleótidosUES se disuelven por completo. </li><li> Añadir UDI a una concentración final de 25 mM de crecimiento exponencial de las células DT40 y mezclar la suspensión celular también. Se incuban las células durante 20 minutos a 38 ° C y 5% CO 2. </li><li> Después de la incubación con la primera etiqueta, añada CldU a una concentración final de 250 M y el tratamiento de las células como se describe en el paso anterior. </li><li> Lavar las células con PBS enfriado con hielo y resuspender ellos en una concentración de 7,5 x 10 5 células / ml en PBS frío. Mantener las células marcadas en el hielo. </li></ol> El procedimiento de etiquetado descrito es sólo una sugerencia y puede ser modificado para responder a preguntas específicas. Por favor refiérase a la sección de discusión para obtener más información sobre el diseño experimental. 3. Lisis celular y el ADN difusión Materiales: láminas de vidrio, fibra de solución de lisis <ol><li> Prepare la solución de lisis de fibra: 50 mM EDTA y SDS al 0,5% en 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><liPunto&gt; 2 l de la suspensión celular a un extremo de la lámina de vidrio. Deje secar al aire durante 5 minutos o hasta que el volumen de la caída se reduce considerablemente, pero no secas. </li><li> Pipeta de solución de lisis 7 l en la parte superior de la suspensión celular y revuelva suavemente con la punta de la pipeta para mezclar las soluciones. Incubar durante 2 minutos para la lisis celular para continuar. </li><li> Inclinación de diapositivas a 15 ° para permitir que las fibras se extienden a lo largo de la diapositiva. </li><li> Una vez que la solución de fibra ha alcanzado la parte inferior de la diapositiva, coloque horizontalmente para secar al aire. Después del secado, una delgada línea, opaco debe ser visible a lo largo de la diapositiva. En este punto, el inicio de las fibras estiradas se debe marcar con un lápiz como después de la tinción de la línea no será visible por más tiempo. Esta marca posterior le ayudará a localizar las fibras en el microscopio. </li></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia Materiales: metanol, ácido acético, ácido clorhídrico, 5% de BSA en PBS, jar manchas, anti-BrdU (ratón) de anticuerpos,anti-BrdU (ratón) de anticuerpos de oveja anti-ratón Cy3 anticuerpo de cabra anti-rat Alexa Fluor 488 anticuerpos, Vectashield medio de montaje, cubreobjetos, esmalte de uñas <ol><li> Sumerja los portaobjetos en metanol / ácido acético (3:1) en una cubeta y se incuba durante 10 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos en agua destilada H 2 O, y luego sumergirse en 2,5 M de HCl durante 80 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos. </li><li> Retirar los portaobjetos de la cubeta y recoger el exceso de PBS con una toalla de papel. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal y BSA pipeta de 5% en la parte superior de cada diapositiva. Cubrir los portaobjetos suavemente con un cubreobjetos para difundir la BSA de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuba durante 20 minutos. </li><li> Diluir los anticuerpos primarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:25 anti-BrdU (ratón) y 1:400 anti-BrdU (rata). </li><li> Mover el cubre suavemente el portaobjetos de vidrio para eliminarlo. No aplicar la fuerza si la hoja de la cubierta se adhiere a la diapositiva. La diapositiva puede ser rehidratada en PBS hasta que el cubreobjetos se suelta unad se puede quitar con facilidad. Recoger BSA exceso con una toalla de papel y la desliza horizontalmente. Pipeta de 50 l de la solución de anticuerpo primario en cada diapositiva. Cubrir de nuevo con un cubreobjetos para difundir la solución de anticuerpos de manera uniforme sobre la diapositiva y se incuban en una cámara húmeda durante 2 horas. </li><li> Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos </li><li> Diluir los anticuerpos secundarios en el 5% de BSA en las siguientes concentraciones: 1:500 de oveja anti-ratón Cy3 y 1:400 de cabra anti-rat Alexa Fluor 488. </li><li> Aplique 50 l de la solución de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Proteger a las diapositivas de la luz y se incuba durante 1 hora. </li><li> Después de retirar el cubreobjetos, este lavado tres veces en PBS durante 5 minutos. </li><li> Agregar una gota de medio Vectashield montaje en cada diapositiva y colocar un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y eliminar el exceso de líquido alrededor de ella con una toalla de papel. Sello cubreobjetos con uñas transparente polish y déjelos secar. Tienda de las diapositivas a -20 ° C. </li></ol> 5. De adquisición de imágenes Materiales: cámara microscopio de fluorescencia, Ponga una gota de aceite de inmersión en un portaobjetos cerca de la marca del lápiz y empezar a localizar las fibras. Por lo general, hay un haz de fibras principales, pero estas fibras son demasiado enredado y no puede ser analizado más adelante. Aléjese del paquete principal para encontrar áreas en las que las fibras están claramente separados el uno del otro (Fig. 2). Queremos seleccionar las imágenes que sólo utiliza un canal de color con el fin de evitar el sesgo. Luego, tomaría aproximadamente 10 imágenes de cada línea de tiempo del punto, la concentración o celular. Sin embargo, el número de imágenes depende de muchas fibras se pueden contar en cada imagen. Se mueven a lo largo de la diapositiva para tomar las fotos diferentes, como un área de la diapositiva no puede proporcionar la longitud de fibra o de las estructuras representativas de replicación. 6. Análisis de datos Materiales: Imagen del programa de análisis, por ejemplo, ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importar imágenes en un programa de análisis de imagen. Medir las longitudes de los tramos de fibra y / o el recuento de las estructuras de reproducción diferentes (Fig. 3). Sólo cuentan las fibras que son claramente visibles y que no se extienden sobre el borde de la imagen. Por lo general medir la longitud de alrededor de 100 fibras y el recuento de 150 a 200 estructuras de reproducción y que se repiten los experimentos individuales por lo menos tres veces. 7. Los resultados representativos: ADN recién replicado se puede visualizar como líneas de anticuerpos marcados con análogos de nucleótidos. En nuestros experimentos un tenedor en curso se representa como adyacentes señales rojas y verdes (Fig. 3). El protocolo de doble etiquetado también nos permite definir cuatro tipos principales de estructuras de repetición: 1) nuevos eventos de iniciación se puede divi<html> ed los orígenes que han disparado mientras que las células se incubaron con la primera etiqueta y origen que se han disparado durante la incubación con la segunda etiqueta. Los primeros constan de vecinos verde-rojo-verde de señales y el último de una línea verde solamente. 2) eventos de terminación se manifiestan como al lado de color rojo-verde-rojo señales. 3) origen entremezclados son los sitios en el genoma de origen muy próximas entre sí. Tales sitios constan de orígenes consecutivos y señales de terminación. 4) en función del diseño experimental, se estancó / horquillas colapsado se puede definir como una señal en rojo sólo el 7 o una línea roja seguida de una zona verde de 8,9 a corto. Usando las condiciones descritas aquí, las células de tipo salvaje DT40 tienen una velocidad promedio de tenedor de 0,4 m / min. Podemos detectar aproximadamente el 63% se bifurca en curso, el origen del 10%, 16% de las horquillas se estancó (rojo vías únicamente), terminaciones 8% y 3% de fibras entremezcladas. <html> La figura 1 &quot;/&gt; . Figura 1 (A) El lado izquierdo de la caricatura representa el primer paso del procedimiento de marcaje de ADN: la adición de UDI de crecimiento exponencial de las células DT40 conduce el análogo de nucleótido que se incorpora fácilmente a la líder de nueva síntesis, y quedando las hebras de ADN. Esto puede ser visualizado mediante el uso de un anticuerpo específico, y aparecerá como una línea roja cuando se observa bajo el microscopio. Posteriormente, el mismo procedimiento se repite con CldU como se muestra en la parte derecha de la figura. Después de la incubación con el análogo de los nucleótidos en segundo lugar, un tenedor de activos será visible como un adjunto rojo-verde las vías. La longitud de fibra media es proporcional a la duración de la incubación de los análogos de nucleótidos. (B) de ADN de las células lisadas DT40 se estira por la gravedad sobre un portaobjetos de microscopio y los análogos de nucleótidos incorporados son visualizados por el uso de anticuerpos específicos y microscopía de fluorescencia. igura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Una imagen de fluorescencia muestra representativa de las fibras de tipo salvaje células DT40 posteriormente etiquetados con UDI y CldU durante 20 minutos cada uno. La mayoría de las fibras están bien separadas unas de otras y por lo tanto se puede analizar con facilidad. La barra blanca representa el 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 La técnica de fibra de doble etiquetado permite distinguir entre las estructuras de reproducción diferentes, 1 - horquillas de replicación activa, 2 - los nuevos sitios de replicación del ADN (lanzamiento de nuevos orígenes), 3 - terminaciones tenedor (dos tenedores de convergencia), 4 - fibras entremezcladas (lugares de orígenes muy próximas entre sí) y 5 - las horquillas se estancó (sólo señal de color rojo).

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se describe un método que permite el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en un nivel sola molécula. En los últimos diez años, las diferentes versiones de la técnica del ADN fluorografía fibra se han desarrollado para visualizar el movimiento de las horquillas de replicación individuales dentro de las células vivas. El parámetro crítico en todas estas técnicas es el procedimiento utilizado para obtener el mejor estiramiento de ADN en superficies de vidrio proporciona bien separadas las fibras de ADN. Un paso crucial para lograr esto es el tiempo de incubación de la suspensión de células en el portaobjetos de un microscopio, así como el tiempo de lisis. Estos parámetros dependen de la temperatura y el flujo de aire en un laboratorio particular y debe ser determinada empíricamente. La parte práctica de un experimento de fibra de ADN se realiza generalmente en un día. Sin embargo, la adquisición de imágenes y análisis posteriores es más tiempo y requiere práctica. El protocolo de etiquetado puede ser adApted para responder a diversos problemas científicos: el uso de un agente que interfiere con la replicación en el etiquetado segundo pulso monitores elongación tenedor / estancamiento en respuesta al estrés replicativo. En este escenario, la primera etiqueta no necesita ser lavado como el segundo de nucleótidos, se añade en exceso. Por otra parte, los fármacos que impiden la replicación se puede utilizar en combinación o sólo después de la adición de la primera etiqueta. Esto requiere de la primera etiqueta y la droga que se elimina antes de que el análogo de los nucleótidos segundo se aplica. Este procedimiento permite determinar la importancia de algunos factores de reparación del ADN en la estabilidad replicativa tenedor / recuperación en condiciones de estrés replicativo (tenedor es decir, estancamiento y / o colapso). Digno de mención, un análisis más detallado de los pormenores del programa de la replicación del ADN se podría realizar con el uso de una combinación de enfoques alternativos de ADN peinado y la fluorescencia de hibridación in situ. Esto, sin embargo, es técnicamente más difícil y requiere gastosequipos intensiva. La capacidad de analizar cualitativa y cuantitativamente los detalles de la replicación del ADN proporciona una herramienta esencial para la investigación de los defectos en la replicación del ADN en sí, así como las vías que suprimir la inestabilidad genómica asociada con las horquillas de replicación. Sin lugar a dudas, esta prueba también ayudará a arrojar luz sobre los mecanismos de replicación mediada por la reparación del ADN que permiten a las células normales de respuesta / adaptación a los cambios ambientales, así como la forma en las células cancerígenas utilizan estos mecanismos para resistir la toxicidad de los fármacos que se dirigen las horquillas de replicación.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Fetal de oro de suero bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de pollo </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-yodo-2&#39;-desoxiuridina (UDI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-cloro-2&#39;-desoxi-uridina (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos No1 </td><td> Científicos del laboratorio suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield medio de montaje </td><td> H-1000 Vector Lab. </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-BrdU (ratón) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-BrdU (rata) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> de oveja anti-ratón Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> de cabra anti-rat Alexa Fluor 488 anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Mantenimiento de la estabilidad de replicación tenedor es de suma importancia para la división de las células para preservar la viabilidad y prevenir enfermedades. Los procesos involucrados no sólo garantizar la duplicación del genoma fieles en la cara del daño del ADN endógeno y exógeno, sino también prevenir la inestabilidad genómica, un factor causal reconocido en el desarrollo tumoral. A continuación, describimos un microscopio de fluorescencia basada en simple y rentable método para visualizar la replicación del ADN en las células B aviares línea DT40. Esta línea celular es una herramienta poderosa para investigar la función de proteínas in vivo mediante genética inversa en las células de vertebrados 1. Fluorografía ADN fibra en DT40 células que carecen de un gen específico permite dilucidar la función de este producto de genes en la replicación del ADN y la estabilidad del genoma. Los métodos tradicionales para analizar la dinámica de replicación tenedor en las células de vertebrados se basan en la medición de la tasa global de la síntesis de ADN en una población de células marcadas con pulso. Este es un enfoque cuantitativo y no permite un análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN. En contraste, la tasa de movimiento de la horquilla activa se puede seguir directamente cuando se utiliza la técnica de fibra de ADN 4.2. En este enfoque, el ADN naciente está etiquetado en vivo por la incorporación de nucleótidos halogenados (Fig. 1A). Posteriormente, las fibras individuales se extienden en un portaobjetos de microscopio, y las vías de replicación de ADN marcado se tiñen con anticuerpos específicos y se visualizan por microscopía de fluorescencia (Fig. 1B). Iniciación de la replicación, así como la direccionalidad tenedor se determina por el uso consecutivo de dos análogos de diferente modificado. Además, el enfoque de doble etiquetado permite el análisis cuantitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S, es decir, la replicación de estructuras tales como tenedores en curso y se estancó, la densidad del origen de replicación, así como terminaciones tenedor. Por último, el procedimiento experimental se puede lograred en un día, y sólo requiere de equipos de laboratorio general y un microscopio de fluorescencia.

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, un sistema vertebrado modelo genético, proporciona una poderosa herramienta para analizar la función de proteínas. Aquí se describe un método sencillo que permite el análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en células DT40 en el nivel de moléculas individuales.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.6K vistas.  University of Oxford. DT40, un sistema vertebrado modelo genético, proporciona una poderosa herramienta para analizar la función de proteínas. Aquí se describe un método sencillo que permite el análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en células DT40 en el nivel de moléculas individuales.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Investigación

Biología

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.