Протокол описывает, как записать профиль подвижности ионов для фрагментов, образующихся при активации молекулы в масс-спектрометре, и различать изомерные структуры. Протокол позволяет классифицировать гликаны на 11 групп в отношении некоторых из их ключевых структурных особенностей и, таким образом, предоставлять информацию, которую в противном случае трудно получить. Он может служить для создания молекулярных сетей, которые являются чрезвычайно общими и подходят для многих молекулярных семейств, таких как метаболиты или лекарства, представляющие интерес во многих областях исследований.
Этот подход максимально использует новую концепцию в спектрометрии подвижности ионов и будет полезен там, где масс-спектрометрия сама по себе не сможет различать две структуры. Эксперимент требует хорошего владения масс-спектрометрией и подвижностью ионов. Тем не менее, экспериментатор должен быть успешным в реализации метода, если тщательно следовать каждому из шагов.
Продемонстрировать процедуру будет Саймон Олливье, аспирант из моей лаборатории. Для начала настройте однопроходную последовательность IMS со страницы Настройка, переведите инструмент в режим mobility mode и откройте окно Управление циклической последовательностью. Выберите Расширенный режим на вкладке Циклические функции этого нового окна, выберите Добавить пакет, а затем Одноканальный/Многопроходный.
Дождитесь появления последовательности событий мобильности на вкладке Sequence того же окна. Адаптируйте последовательность таким образом, чтобы все калибрантные ионы делали один проход вокруг циклической гоночной трассы IMS. Не изменяйте время впрыска или время извлечения и извлечения, однако уменьшите отдельное время до одной миллисекунды.
Если некоторые ионы калибровочной смеси не помещаются в отображаемое окно времени прибытия, измените синхронизацию IMS с толкателем анализатора TOF ортогонального ускорения, увеличив количество толчков на бункер во вкладке Настройки АЦП. Чтобы записать двухминутное приобретение в окне Управление циклической последовательностью, нажмите кнопку «Получить», чтобы открыть всплывающее окно «Параметры получения», введите имя файла, описание и продолжительность получения, минуты и нажмите кнопку «Сохранить». Переключите прибор в режим TOF со страницы MS Tune, чтобы проверить стабильность сигнала.
Запишите полное получение МС образца в течение одной минуты, что будет полезно для проверки изотопного рисунка и наличия потенциальных загрязняющих веществ. Переведите инструмент в режим MSMS на вкладке профиля Quad/MS на главной странице Tune. Выберите массу целевого железа в поле MSMS Mass для выделения в квадруполе.
Запишите одноминутное приобретение, чтобы проверить изоляцию предшественника при обработке данных. Чтобы выполнить выбор интересующего изомера на основе мобильности, переключите инструмент в режим мобильности в окне Управление циклической последовательностью на вкладке Циклические функции выберите Добавить связку, а затем Нарезка. Дождитесь появления сложной последовательности событий мобильности на вкладке Последовательность.
Поместите событие Eject and Acquire сразу после первого отдельного события и нажмите кнопку Выполнить. Ищите результаты начального разделения, которые будут отображаться в режиме реального времени. Увеличьте продолжительность первого отдельного события для многопроходного разделения, изменив значение времени для этого события в последовательности до тех пор, пока разрешение пиков IMS не станет удовлетворительным.
Запишите одноминутное приобретение для справки. Нажмите кнопку Пауза, поместите событие Извлечение и Получение под событиями Извлечение, Извлечение в предварительное хранилище и Удержание и извлечение. Отрегулируйте продолжительность событий таким образом, чтобы целевой пик находился в области «Извлечь в предварительное хранилище», а любой другой ион — в области извлечения или удержания и извлечения.
Поместите событие Eject and Acquire в конце последовательности под событием Reinject from Pre-Store и вторым отдельным событием. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы отобразить выбранное население. Проверьте качество изоляции.
Запишите одноминутное приобретение для справки. На вкладке Sequence (Последовательность) в столбце рядом с заданным пользователем временем событий найдите суммированное время всех событий. Обратите внимание на Time Abs, найденное в строке события Reinject from Pre-Store для выполнения калибровки CCS.
Установите продолжительность события Separate непосредственно при извлечении и получении равным одной миллисекунде. В строке Повторное добавление из предварительного хранилища установите флажок Включить активацию и оптимизируйте фрагментацию с помощью встроенного элемента управления. Если фрагментация не удовлетворяет встроенному элементу управления, снимите флажок Включить активацию и приступайте к ручной оптимизации напряжений обратной установки, увеличению градиента предварительного массива и снижению напряжения смещения массива до тех пор, пока результаты не будут удовлетворительными.
Чтобы записать двухминутное приобретение во всплывающем окне «Приобретение», установите флажок «Сохранить время дрейфа», чтобы создать файл, содержащий только время прибытия, вместо «M over Z», помеченного как _dt.raw. После выполнения анализа MS смеси арабиноксилана пентасахарида спектр показал изотопную картину с одним пиком при M над Z 685,24, предполагая, что эти два соединения являются изомерными по своей природе. Аддукты пентасахаридов были разделены через циклическую ячейку IMS, и три пика были разделены с разным временем прибытия.
Чистый XA3XX показывает пики в 83 и 90 миллисекунд, в то время как XA2XX демонстрирует пик в 94 миллисекунды. После первого этапа разделения IMS ионы, принадлежащие XA3XX, были выброшены, и пик в 94 миллисекунды был выбран для анализа IMS-IMS. Трехпроходное разделение выполняли после повторного введения иона без активации, а пик для XA2XX был получен через 199 миллисекунд.
Сгенерированные данные IMS-IMS MS были деконвертированы с использованием времени прибытия и измерений M over Z, генерируя спектры IMS-IMS. Пики относительной интенсивности выше 0,2% были экспортированы для калибровки CCS, в результате чего получился центроидированный спектр IMS-IMS, откалиброванный CCS. Всегда важно проверить выделение иона-предшественника, в противном случае спектр может исходить из смеси интересующего соединения и загрязняющих веществ.
Ранее мы использовали спектры IMS-IMS для построения сетей и классификации соединений, но они также могут быть использованы для поиска по базам данных для идентификации соединений. Этот метод появился совсем недавно, но мы ожидаем, что он будет чрезвычайно полезен в гликомике, а также в любом контексте, где аналитики сталкиваются с изомерными молекулами.
