Esta nueva técnica combina la espectrometría de masas de movilidad iónica con el modelado molecular y la teoría de la dinámica de reacciones para determinar la termoquímica relativa de dos reacciones de disociación competitivas de un complejo ternario. La combinación de estas técnicas caracteriza las vías de reacción de los reactivos y productos, las estructuras conformacionales y la afinidad del ligando para formar un complejo ternario con el ion metálico. Esta investigación modela la reactividad de dos posibles etiquetas peptídicas para la purificación de proteínas recombinantes, donde la etiqueta reacciona con el metal quelado por ácido nitrilotriacético en una columna de afinidad metálica inmovilizada.
Comience cargando la muestra de 2 mililitros en una jeringa de nariz roma de 2,5 mililitros e inyectando la muestra en el electrospray del instrumento utilizando la bomba de jeringa del instrumento a un caudal de 10 microlitros por minuto. Coloque el instrumento en modo de espectrometría de masas de movilidad de iones negativos, o modo IM-MS. Identifique el patrón de isótopos de masa a carga del complejo ternario alternativo de unión a metales con carga negativa, o complejo amb-metal-NTA, abriendo el programa de espectrometría de masas y seleccionando Espectro.
A continuación, seleccione Herramientas seguidas de Modelo de isótopos. En la ventana emergente, enumere la fórmula molecular del complejo, marque la casilla Mostrar ion cargado, ingrese 1 para la carga del negativo y haga clic en OK.In el patrón de isótopos mostrado del complejo, anote el pico de masa más bajo. En el software del instrumento, seleccione Configuración seguida de Perfil cuádruple.
A continuación, seleccione Manual fijo e introduzca la masa del pico de patrón isotópico más bajo. Haga clic en Actualizar y cierre la ventana. Nuevamente, seleccione Configuración y luego haga clic en Resolución de cuádruple.
Recopile los espectros IM-MS de iones negativos comenzando con la primera energía de colisión de transferencia utilizando una duración de ejecución de 5 minutos y un tiempo de escaneo de 2 segundos. Repita para recoger los espectros IM-MS para cada una de las otras energías de colisión. Utilice las distribuciones de tiempo de llegada integradas, o áreas ATD, para el complejo ternario amb-metal-NTA y dos productos, complejo NTA-metal y complejo amb-metal, para normalizar a una escala porcentual relativa.
A partir de la disociación inducida por colisión de umbral replicado, o mediciones TCID, encuentre la media y las desviaciones estándar de cada punto de datos. Luego, convierta la energía de colisión de transferencia del marco de laboratorio a la energía de colisión del centro de masa. Para medir las secciones transversales de colisión, recopile los espectros IM-MS de iones negativos de la muestra de poli-DL-alanina de 10 ppm, o PA, durante 10 minutos utilizando las condiciones de funcionamiento instrumental.
Luego, recoja los espectros IM-MS de cada complejo ternario durante 5 minutos. Extraiga el ATD de cada uno de los complejos PA y ternario y exporte sus archivos al software de espectrometría de masas utilizando la opción Retain Drift Time. Encuentra los tiempos medios de llegada de los máximos de las curvas ATD correspondientes.
Utilice un método de calibración de sección transversal para convertir los tiempos de llegada promedio en secciones transversales de colisión del complejo ternario. Desde el menú principal de CRUNCH, abra el archivo de texto GB5 que contiene la energía del centro de masa o las intensidades relativas dependientes de ECM de los productos. Responder No a los parámetros de lectura.
A continuación, seleccione Modelado seguido de Establecer todos los parámetros. De las opciones del modelo de reacción, elija la opción CID de umbral predeterminada seguida de RRKM con integración sobre la distribución de transferencia de energía del complejo ternario. Introduzca 2 para los canales de productos independientes modelados y seleccione Calcular secciones transversales.
Para el tipo de modelo no complicado, elija la sección transversal de 0 Kelvin, que incluye la corrección estadística RRKM de los cambios cinéticos debido a la ventana de tiempo de 50 microsegundos desde la celda de colisión hasta el detector de tiempo de vuelo. Para las opciones de convolución, elija la integral doble de Tiernan, que incluye la convolución sobre distribuciones de energía de traslación entre el ion complejo ternario y el gas de colisión de argón. Para el método de integración numérica, elija Cuadratura gaussiana con secciones transversales guardadas previamente.
Desde las opciones para ingresar los parámetros moleculares, ingrese G para leer el archivo de modelado estructural con las frecuencias vibracionales y rotacionales PM6 del complejo ternario. Respuesta Sí a la pregunta: ¿Es atómico uno de los reactivos? Escriba la ubicación y el nombre del archivo de modelado.
Ingrese 1 para la carga en el ion y 1.664 para la polarizabilidad del gas argón. La masa del ion y la masa del objetivo son para el complejo ternario y el argón, respectivamente, y se leen automáticamente desde el archivo de texto GB5. Introduzca 0 para vibraciones armónicas.
Pulse Intro para leer las constantes de rotación 1D y 2D del archivo de modelado estructural. Seleccione los valores predeterminados de 0 para los tratamientos de rotor obstaculizado y 1 para la simetría de moléculas. Elija los 300 Kelvin predeterminados para la temperatura del reactivo.
Seleccione Integración para el método de reducción de la densidad de la matriz de estados. Seleccione Sí para truncar la distribución de energía. Introduzca el número de onda 40000 para la energía máxima para la distribución, el número de onda 2 para el tamaño del contenedor y 32 para el número de puntos en la distribución de energía.
Para los parámetros para el modelo TCID/RRKM, elija Sí para Cambiar, introduzca 0 para Tiempo fijo y 0,000050 segundos para el límite superior de la ventana de detección. Para el canal de producto 1, seleccione 1 para un solo estado de transición de las opciones de canal de disociación y 0 para ninguna disociación secuencial. Para el tipo de estado de transición, elija 1 para orbitar.
Seleccione G para leer los archivos de programa de modelado que contienen los parámetros rotacionales y vibracionales PM6 para el complejo amb-metal más productos NTA. Escriba No para:¿Es atómica una de las especies del estado de transición límite de espacio de fase, o PSL TS? Introduzca la ubicación y el nombre del archivo complejo amb-metal.
Use 1.062 para frecuencias de escala, presione Enter para el número de átomos e ingrese No para: ¿Es lineal la molécula? Repita lo mismo para el archivo de modelado que contiene las frecuencias vibracionales y rotacionales del producto NTA. Introduzca la descripción del TS en órbita. Ingrese 1.0 para la carga del ion amb-metal y luego ingrese la polarizabilidad y el momento dipolar de NTA.
Seleccione 0 Kelvin para la temperatura de rotación y dipolo bloqueado para el tratamiento del estado de transición orbital. Introduzca las masas medias del ion amb-metal y NTA. Pulse Intro para leer las constantes de rotación 1D y 2D de los archivos de modelado.
Seleccione 0 para rotores obstaculizados, 1 para simetría de moléculas y 1 para degeneración de reacción. Introduzca la opción Sin cambios. Para el canal de producto 2, seleccione 1 para el estado de transición único, 0 para ninguno para la disociación secuencial y 1 para orbitar para el tipo de estado de transición.
Seleccione G para leer en los archivos de modelado que contienen los parámetros rotacionales y vibracionales PM6 para el complejo NTA-metal y los productos amb. Luego, ingrese la descripción del TS en órbita. Ingrese 1.0 para la carga del ion complejo metálico NTA, e ingrese la polarizabilidad y el momento dipolar del amb. Seleccione 0 Kelvin para la temperatura de rotación y dipolo bloqueado para el tratamiento del estado de transición orbital.
Introduzca las masas medias del complejo NTA-metal y de los productos amb. Pulse Intro para leer las constantes de rotación 1D y 2D de los archivos de modelado. Seleccione 0 para rotores obstaculizados, 1 para simetría de moléculas y 1 para degeneración de reacción.
A continuación, introduzca Sin cambios. Para manejar rotaciones 2D inactivas, seleccione las opciones predeterminadas para la distribución estadística del momento angular e integre la distribución P-E, G sobre J. Utilice el valor predeterminado de 32 en el número de puntos de la integración.
En el menú Modelo, seleccione Optimizar parámetros para ajustar datos e introduzca la energía mínima y la energía máxima para iniciar y finalizar el ajuste de datos, respectivamente. Seleccione 1 para las desviaciones estándar experimentales de los modelos de ponderación. Según los datos, seleccione una desviación estándar mínima aceptable de 0,01 a 0,001.
Utilice el valor predeterminado para el límite de convergencia E0 y seleccione No para mantener cualquier parámetro en el valor actual, 0,5 y 2,0 electronvoltios para los límites inferior y superior y 2 para el método de evaluación de derivadas. En el menú Optimización, seleccione Iniciar optimización. El programa CRUNCH optimizará el modelo TCID seleccionado para los datos experimentales.
Finalmente, en el menú Modelo, seleccione delta-H y S en T para la evaluación termoquímica de los dos canales de disociación. La imagen representativa muestra las estructuras primarias de los péptidos A y H de unión metálica alternativa. El color resalta los posibles sitios de unión de metal.
La dependencia energética para formar los iones producto amb-metal y NTA-metal se muestra aquí. La energía de colisión del centro de masa, donde hay un 50% de disociación del complejo ternario amb-metal-NTA, se incluye en los gráficos. Las imágenes representativas muestran el modelo dinámico para el método TCID resuelto energéticamente.
Las colisiones entre el complejo ambH-zinc-NTA más el argón dan como resultado la disociación con el complejo ambH-zinc y los productos libres de NTA, o complejo NTA-zinc y ambH libre. Las energías umbral E1 y E2 equivalen a las entalpías de disociación de 0 Kelvin para las reacciones complejo ambH-zinc-NTA a complejo ambH-zinc y NTA libre, o complejo ambH-zinc-NTA a complejo NTA-zinc y ambH libre, respectivamente. Aquí se muestran los complejos amb-metal-NTA ternarios optimizados por geometría PM6 de A y H.
Estos conformadores se utilizaron en el modelado TCID de los datos experimentales y se seleccionaron de otras estructuras candidatas comparando sus energías electrónicas PM6 y cómo sus secciones transversales de colisión calculadas en comparación con las secciones transversales de colisión IM-MS midieron las secciones transversales. El TCID de energía resuelta de los cuatro complejos amb-metal-NTA se representa en estas imágenes. Para las especies A y H, los iones producto de amb-metal y NTA-metal con los enrevesados ajustes de umbral CRUNCH se muestran aquí.
Los valores de energía son las entalpías de disociación a 0 Kelvin para las reacciones amb-metal-NTA a amb-metal y NTA libre, o amb-metaL-NTA a NTA-metal y amb libre. Aquí se muestra una comparación de las energías libres de asociación de Gibbs en kilojulios por mol y constantes de formación derivadas de las entalpías de disociación, cero neto Kelvin, con cálculos de mecánica estática utilizando los parámetros PM6. La reacción de NTA-níquel y ambA libre para formar el complejo ambA-níquel-NTA exhibe la constante de formación más alta y representa la reacción donde la proteína marcada con ambA es inmovilizada por el NTA-níquel dentro de la columna de afinidad.
El ajuste CRUNCH requiere una cuidadosa selección de reactivos y productos para obtener energías umbral precisas. Se requiere experiencia en modelado molecular para obtener las estructuras y parámetros moleculares confiables. Los métodos generales descritos aquí podrían desarrollarse para evaluar la efectividad de moléculas diseñadas para unirse a cofactores metálicos y sitios activos de proteínas para bloquear las funciones enzimáticas.
