Esta vertical presenta pasos importantes en el montaje de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular con receptores transmembrana funcionales. Estas columnas se pueden utilizar para la identificación de pequeñas moléculas presentes en extractos complejos e interactuando con receptores transmembrana inmovilizados. Las columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular aceleran la identificación de compuestos biológicamente activos presentes en mezclas complejas.
El uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular puede ser de particular interés para aquellos interesados en la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en matrices naturales complejas, como extractos de plantas, hongos o bacterias. Para comenzar, prepare una solución madre de benzamidina de 200 milimolares disolviendo 120 de benzamidina en cinco mililitros de agua desionizada ultrapura. Prepare una solución madre de PMSF de 10 milimolares disolviendo 0.017 gramos de PMSF en 10 mililitros de etanol en una campana de humos.
Prepare el cóctel inhibidor de proteasas 100X disolviendo la mezcla de inhibidores de proteasa disponibles comercialmente en un mililitro de agua desionizada ultrapura. Mezclar bien y alícuota de 200 a 300 microlitros del cóctel. Prepare una solución madre de ATP de 100 milimolares disolviendo 55.114 miligramos de hidrato de sal disódica de ATP en un mililitro del agua ultrapura ionizada.
Mezclar bien y alícuota 100 microlitros de la mezcla. Prepare el tampón disolviendo 3.03 gramos de Tris-HCL, 2.9 gramos de cloruro de sodio, 0.22 gramos de cloruro de calcio anhidro, 0.2 gramos de cloruro de magnesio hexahidratado y 0.19 gramos de cloruro de potasio en 500 mililitros de agua ultrapura desionizada. Prepare el tampón de homogeneización mezclando 17,3 mililitros del tampón Tris con 0,3 mililitros de solución madre de benzamidina, 0,2 mililitros de solución madre de PMSF, 0,2 mililitros de cóctel inhibidor de proteasas, 20 microlitros de solución madre de ATP, dos mililitros de glicerol y 0,029 gramos de EDTA.
Ajuste el pH a 7.4 usando solución de ácido clorhídrico. Gire hacia abajo las células cosechadas a cuatro grados Celsius durante cinco minutos a 400 x g y retire el sobrenadante y lave el pellet celular restante con 10 mililitros de PBS helado de 1X pH 7.4. Deseche el sobrenadante y agregue 20 mililitros de tampón de homogeneización.
Coloque el tubo cónico sobre hielo. Transfiera la suspensión celular a una amoladora de tejido homogeneizador Dounce de 40 mililitros, homogeneice la suspensión manualmente en hielo utilizando 40 golpes de mortero hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión celular homogeneizada a un tubo cónico de 50 mililitros, deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico.
Guarde el pellet de membrana celular y deseche el sobrenadante. Prepare el tampón de solubilización mezclando 8,7 mililitros de la solución tampón con 0,1 mililitros de solución madre de PMSF, 0,15 mililitros de solución madre de benzamidina, 0,1 mililitros de cóctel inhibidor de proteasas, 10 microlitros de solución madre de ATP, un mililitro de glicerol y 0,2 gramos de colato de sodio. Transfiera el tampón de solubilización al tubo cónico con fragmentos de membrana celular.
Y resuspendir el pellet. Gire la mezcla resultante a 150 RPM a cuatro grados Centígrados durante 18 horas. Después de 18 horas, centrífuga la mezcla de solubilización a cuatro grados Celsius durante 30 minutos a 47, 900 x g.
Agregue 100 miligramos de IAM. PC. Partículas DD2 al sobrenadante y girar la mezcla de suspensión resultante a 150 RPM a cuatro grados centígrados durante una hora. Prepare el tampón de diálisis en cuatro litros de agua desionizada ultrapura agregando 24 gramos de Tris-HCl, 23.4 gramos de cloruro de sodio, 0.06 gramos de cloruro de calcio, 5.85 gramos de EDTA y 0.07 gramos de PMSF.
Disuelva la PMSF primero en un pequeño volumen de etanol y luego agregue lentamente al vaso de precipitados con el tampón. Corte 10 centímetros de tubo de diálisis de membrana de celulosa para preparar el tubo de diálisis y transfiera la suspensión que contiene IAM. PC. Partículas DD2 y fragmentos de membrana celular en el tubo de diálisis.
Cierre ambos extremos del tubo de diálisis con clips de tubo de diálisis. Coloque el tubo de diálisis en el tampón de diálisis. Después de 24 horas, coloque el tubo de diálisis en el tampón de diálisis recién preparado y continúe la diálisis durante otras 24 horas.
Prepare un tampón de acetato de amonio de 10 milimolares pH 7.4 que se utilizará para lavar el IAM. PC. Partículas DD2 y experimentos de caracterización en columna disolviendo 0,778 gramos de acetato de amonio en un litro de agua ultrapura desionizada. Después de 48 horas de diálisis, retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis y transfiera el contenido del tubo de diálisis a un tubo cónico de 15 mililitros.
Deseche el sobrenadante y lave el pellet restante tres veces con 10 mililitros de tampón de acetato de amonio. Después del tercer lavado, vuelva a suspender el pellet restante en un mililitro de tampón de acetato de amonio. Mézclelo bien y use la suspensión resultante para empacar la columna de vidrio de 5 x 20 para producir la columna de cromatografía CMAC.
Para empacar la columna, coloque un filtro inferior previamente empapado con tampón de acetato de amonio en el soporte del filtro. Coloque el soporte del filtro en la columna de vidrio y atornille la tapa de la columna para asegurar la posición del soporte. Coloque la columna verticalmente en una abrazadera para los dedos y asegúrela en el soporte de laboratorio.
Coloque un vaso de precipitados debajo de la columna, transfiera un pequeño volumen de la suspensión a la columna de vidrio lentamente con un pipete de un solo canal que sostenga la punta de la pipeta contra la pared de la columna de vidrio. Para acelerar el proceso de embalaje, retire el búfer de arriba del lecho estacionario con una micropipeta entre cada paso. Coloque un filtro superior y atornille la unidad adaptadora para que no quede un búfer por encima de la fase estacionaria.
Asegure la posición de la unidad adaptadora con el bloqueo del adaptador. Conecte la columna a una bomba de cromatografía líquida de alto rendimiento y, para lavar la columna durante la noche con un tampón de acetato de amonio, ajuste el caudal a 0,2 mililitros por minuto. Para un almacenamiento más prolongado, ejecute la columna con una solución de azida de sodio al 0,05% en tampón de acetato de amonio, usando una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes cuando trabaje con azida de sodio y guárdela a cuatro grados Celsius.IAM.
PC. Las partículas DD2 con fragmentos de membrana celular de neuroblastoma TrkB inmovilizados y en presencia de BDNF dieron lugar a partículas fluorescentes. No se observó fluorescencia en las partículas de IAM encapsuladas en la membrana celular nula de TrkB o cuando no se utilizó BDNF como en las partículas de IAM encapsuladas en la membrana celular de TrkB. Se muestra un cromatograma de afinidad frontal típico de columnas CMAC funcionales de concentraciones crecientes de 7, 8-DHF de un milimolar, 750 nanomolar, 500 nanomolar y 300 nanomolares a los receptores TrkB inmovilizados, que mostraron un cambio dependiente de la concentración en el tiempo de retención.
Una columna CMAC no funcional mostró la falta de cambios dependientes de la concentración en la retención del ligando marcador. Se preparó una columna de control negativo de CMAC inmovilizando fragmentos de membrana celular, no expresando la proteína objetivo para descartar interacciones no específicas. La adición de extracto acuoso de centella asiática de Centu al 0,2% resultó en una reducción significativa de la retención de 7, 8-DHF, lo que indica la presencia de ligandos competidores para el sitio de unión agonista.
La falta de reducción de la retención de 7, 8-DHF en la columna nula TrkB CMAC negativa confirmó aún más la falta de receptores TrkB funcionales en esta columna. El enfoque de cromatografía de pico faltante identificó un compuesto fuertemente retenido en la columna TrkB, mientras que eluía temprano en la columna nula TrkB, lo que indica una interacción específica. Es crucial conocer su fuente de receptores para la columna de cromatografía de afinidad de membrana celular rápida.
Asegúrese de revisar la literatura para diseñar adecuadamente los tampones de homogeneización y solubilización. La columna de cromatografía de afinidad de membrana celular preparada en este protocolo se utilizó para identificar nuevos impactos potenciales de fármacos y para caracterizar la naturaleza de la interacción entre el receptor inmovilizado y sus ligandos naturales.
