Este protocolo es importante ya que muestra bucles cromosómicos de alta resolución y otras características de interacción de corto alcance. La principal ventaja de esta técnica es el mapeo de la organización del genoma en 3D con resolución de nucleosomas con alta relación señal-ruido. Para realizar la valoración de MNasa, descongele un gránulo de una vez 10 a la sexta celda en hielo durante 10 minutos, y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de DPBS, e incube la suspensión celular en hielo durante 20 minutos.
Recoger las células por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante. Resuspender las células peletizadas en 500 microlitros de tampón MB Número uno. Descongelar un vial de 20 unidades por microlitro de MNasa, y diluirlo con 10 milimolares de Tris para las condiciones de digestión descritas en el texto.
Con intervalos de tiempo apropiados de 10 a 20 segundos, agregue un microlitro de la primera solución de digestión de MNase a uno de los cuatro tubos de muestras, vórtice e incube en un ThermoMixer a 37 grados Celsius durante 10 minutos a 800 RPM. Continúe agregando un microlitro de las diluciones restantes de MNasa a las otras alícuotas celulares. Detenga la digestión de la MNasa agregando 200 microlitros de tampón de parada recién preparado a cada tubo en el mismo orden y en el mismo intervalo de tiempo en el que se agregó la MNasa.
Incubar a 65 grados centígrados durante dos horas. Agregue 500 microlitros de PCI a cada muestra y mezcle bien mediante vórtice. Centrifugar a 19,800 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para separar las fases.
Y transfiera la fase acuosa a nuevos tubos. Purifique el ADN utilizando un kit comercial de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya las muestras en 12 microlitros de tampón de elución. Agregue de dos a cinco microlitros de tinte de carga a la muestra de ADN purificada.
Coloque las muestras en un gel de agarosa al 1,5% y elija el mejor grado de digestión para el experimento. Un grado de digestión óptimo muestra poco o ningún fragmento subnucleosomal, y una proporción de 70 a 90% de mono a dinucleosoma. En esta muestra representativa, se seleccionó un grado de digestión intermedio entre los carriles tres y cuatro para los experimentos de seguimiento.
Sobre la base de la valoración de MNasa, digiera la cromatina añadiendo la cantidad adecuada de MNasa a cada alícuota de muestra. Mezclar bien e incubar en la ThermoMixer a 37 grados centígrados, 800 RPM durante 10 minutos. Detenga la digestión de MNasa agregando 1,6 microlitros de EGTA 0,5 molar a cada alícuota e incube en un ThermoMixer a 65 grados centígrados durante 10 minutos con agitación a 800 RPM.
Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Resuspender el gránulo celular en 500 microlitros de tampón 1X NEB 2.1. Agrupar muestras equivalentes a una entrada de cinco veces 10 a la sexta celda o menos para su posterior procesamiento.
Antes de proceder a la ligadura de proximidad, transfiera el 10% de la muestra como control de entrada para monitorear el nivel de digestión de MNasa. Agregue 150 microlitros de Tris de 10 milimolares, 25 microlitros de SDS al 10% y 25 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K al control de la digestión e incube durante la noche a 65 grados centígrados. Recoger la muestra restante por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Resuspenda el pellet en 90 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparado e incube en un ThermoMixer a 37 grados Celsius, 800 RPM durante 15 minutos. Añadir 10 microlitros de cinco unidades por fragmento de microlitro de Klenow e incubar en un ThermoMixer. Luego agregue 100 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparada.
Incubar durante 45 minutos a 25 grados Celsius, 800 RPM, y apagar la reacción enzimática con EDTA como se describe en el texto. Incubar en una termomezcladora durante 20 minutos a 65 grados centígrados, 800 RPM. Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender la muestra en 500 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparada e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente a 15 a 20 RPM. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender la muestra en 200 microlitros de Micro-C master mix four recién preparados, e incube en un ThermoMixer ajustado a 37 grados centígrados durante 15 minutos a 800 RPM.
Para la reticulación inversa y la desproteinación, agregue 25 microlitros de 20 miligramos por microlitro de proteinasa K y 25 microlitros de SDS al 10% a la muestra, e incube a 65 grados Celsius durante la noche con mezcla intermitente. Agregue 500 microlitros de PCI a las muestras y al control de entrada, luego mezcle por vórtice. Separar las fases por centrifugación a 19,800 G durante cinco minutos, y transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
Concentrar el ADN y eluir las muestras en 30 microlitros, y los controles de entrada en 15 microlitros. Aplica un gel de agarosa al 1,5% para separar los mononucleosomas y los dinucleosomas. Extirpar los fragmentos de ADN que tienen un tamaño dinucleosomal y extraer el ADN como se describe en el texto.
Agregue 150 microlitros de perlas preparadas previamente a 150 microlitros de la muestra e incube a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un imán apropiado y espere hasta que la solución se aclare. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 300 microlitros de 1X TBW, y repita este paso.
Repita la separación magnética y, después de que la solución se aclare, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de 0,1X TE. Repetir y resuspender en 50 microlitros de 0,1X TE. Transfiera la solución a tubos de PCR y realice la manipulación del ADN como se describe en el texto. Una vez completada la ligadura del adaptador, lavar la muestra en 1X TBW, desechar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 20 microlitros de 0,1X TE. Optimice el número de ciclos de PCR y amplíe las bibliotecas de secuencias como se describe en el texto. La cromatina de 250.000 células por reacción se digirió con una dilución cuádruple de MNasa.
La concentración más alta, 10 unidades, mostró cromatina sobredigerida que consistía casi exclusivamente en ADN mononucleosomal. La digestión de 250.000 células madre embrionarias de ratón con 0,625 unidades de MNasa ofreció el punto de partida más prometedor para las digestiones preparativas en experimentos de Micro-C. Sin embargo, se debe considerar una concentración intermedia de MNasa entre las condiciones mostradas en los carriles tres y cuatro, correspondiente a cinco unidades por 1 millón de células.
La banda de mononucleosoma ligada por proximidad tenía un tamaño aproximado de 300 pares de bases, similar al de los dinucleosomas. Por lo tanto, la relación de señal de banda mono a dinucleosomal cambió de predominantemente mononucleosomas a dinucleosomas. La calidad y la cantidad de la biblioteca de secuenciación preparada se evaluaron mediante PCR mínima.
La visualización mostró una banda distinta en 420 pares de bases, y ninguna banda para los dímeros adaptadores. Si bien ambas muestras en este estudio mostraron altas tasas de mapas, la muestra buena tuvo una fracción más alta de lecturas cis. Una alta tasa de interacciones transcromosómicas indica eventos de ligadura aleatorios, aunque algunas interacciones transcromosómicas pueden ser importantes.
Además, la buena muestra tenía una tasa moderada de pares de lectura de mapeo hacia adelante-atrás, con distancias inferiores a 500 pares de bases. Esto indicó una baja tasa de dinucleosomas no escindidos por la MNasa que tienen un tamaño similar a dos nucleosomas ligados por proximidad. Un grado adecuado de digestión de la MNasa es crucial para este experimento.
Los nucleosomas sobredigeridos están ligados de manera ineficiente, y la cromatina subdigerida tiene una gran fracción de dinucleosomas no digeridos que pueden contaminar la biblioteca de secuenciación. Micro-C se puede combinar con un enfoque de captura para mapear la organización del genoma específico del locus con una resolución enormemente alta.
