Este protocolo detecta con precisión las características de plegamiento cromosómico en múltiples escalas de longitud con una señal de fondo baja. Por ejemplo, las interacciones potenciadoras del promotor se pueden analizar en el contexto de los compartimentos cromosómicos. El uso de endonucleasas de restricción evita optimizar el nivel de digestión del material de entrada.
No se requiere selección por aislamiento de gel para capturar productos de ligadura. El problema más común es la pérdida de células después de la fijación DSG y la captura de suficiente ADN para producir bibliotecas de alta calidad. Para comenzar, aspire el medio con una pipeta Pasteur acoplada a una trampa de vacío desde la placa de 150 milímetros que contiene 5 por 10 hasta la sexta celdas.
Lave las células dos veces con 10 mililitros de HBSS. Para entrecruzar las células, vierta 23.125 mililitros de la solución de formaldehído al 1% en la placa de 15 centímetros. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, meciendo suavemente el plato a mano cada dos minutos.
A continuación, agregue 1.25 mililitros de glicina 2.5 molar y agite suavemente la placa para apagar la reacción de reticulación, antes de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Continúe la incubación en hielo durante 15 minutos para detener la reticulación. Raspa las células de la placa con un raspador de celdas o un policía de goma y transfiere la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros con una pipeta.
Centrifugar la suspensión a 1.000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante por aspiración. Lave el pellet una vez con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, o DPBS. Luego, centrifugar nuevamente antes de proceder a la reticulación DSG.
Para la reticulación con DSG, resuspenda las celdas granuladas en 9,9 mililitros de DPBS. Luego, agregue 100 microlitros de DSG de 300 milimolares. Mezcle el tubo por inversión y entrecruze las celdas a temperatura ambiente durante 40 minutos en un rotador.
Después de la reticulación, agregue 1.925 mililitros de glicina 2.5 molar, invierta para mezclar e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, centrifugar las células a 2.000 veces G durante 15 minutos y resuspender el pellet en un mililitro de albúmina sérica bovina al 0,05% DPBS antes de transferirlo a un tubo de 1,7 mililitros. Centrifugar las células a 2.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Congele el gránulo en nitrógeno líquido antes de proceder a la captura de confirmación cromosómica. Resuspender la alícuota celular reticulada en un mililitro de tampón de lisis helada que contiene 10 microlitros de cóctel inhibidor de proteasa y transferir a un homogeneizador Dounce durante 15 minutos de incubación en hielo. Mueva lentamente el mortero A hacia arriba y hacia abajo 30 veces para homogeneizar las células e incubar durante un minuto para permitir que las células se enfríen antes de otros 30 golpes.
Después del último golpe, transfiera el lisado a un tubo de 1.7 mililitros. Centrifugar la suspensión lisada a 2, 500 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y mueva o vórtice para resuspender la bolita húmeda.
Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante para obtener una sustancia similar al yogur con grumos mínimos. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de restricción helado antes de la centrifugación. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en 360 microlitros de tampón de restricción mediante pipeteo después de agregar aproximadamente 340 microlitros al volumen de arrastre del pellet, dependiendo del tamaño de la celda.
Reserve 18 microlitros de lisado para probar la integridad de la cromatina, o CI.To el lisado restante, agregue 38 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 1% al tubo hi-C para hacer un volumen total de 380 microlitros y mezcle cuidadosamente pipeteando sin introducir burbujas. Incubar las muestras a 65 grados centígrados sin agitar durante 10 minutos para abrir la cromatina. Luego, coloque inmediatamente el tubo sobre hielo.
Después de preparar la mezcla de digestión con Triton X-100, agregue 107 microlitros de esta mezcla al tubo hi-C para hacer un volumen total de 487 microlitros y digiera la cromatina durante la noche a 37 grados centígrados en un termomezclador con agitación a intervalos. Al día siguiente, transfiera las muestras a 65 grados centígrados durante 20 minutos para desactivar la actividad endonucleasa restante. Después de colocar la muestra en hielo, reserve 10 microlitros de control de digestión, o DC, y guárdelos a cuatro grados centígrados.
Retire la condensación de la tapa con una pipeta o girando. Luego, agregue 58 microlitros de mezcla de relleno de biotina para hacer un volumen total de 535 microlitros. Pipetear suavemente sin formar burbujas antes de incubar a 23 grados centígrados durante cuatro horas en un termomezclador.
Después de la incubación, agregue 665 microlitros de mezcla de ligadura, lo que hace que el volumen de muestra sea de 1, 200 microlitros. Mezclar la muestra pipeteando e incubar a 16 grados centígrados durante cuatro horas en un termomezclador. A continuación, agregue 50 microlitros de proteinasa-K en dos fracciones al tubo de muestra hi-C e incube durante la noche a 65 grados centígrados con agitación a intervalos.
Para la purificación del ADN, agregue etanol 100% frío como el hielo y centrifugar los tubos a 18, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante completamente del lado que no sea pellet y seque la muestra al aire durante 10 minutos o hasta que los pellets estén visiblemente secos. Una vez que los pellets estén secos, solubilizarlos en 450 microlitros de Tris bajo-EDTA por pipeteo o remolino.
Transfiera la suspensión solubilizada a la unidad de filtro centrífugo de 0,5 milímetros, o UFC, con un límite de peso molecular de tres kilodaltones. Centrifugar la UFC a velocidad máxima durante 10 minutos y desechar el flujo. Después del segundo lavado, agregue 80 microlitros de Tris low-EDTA a la columna.
Convertir la columna en un nuevo tubo de recogida durante dos minutos de centrifugación a máxima velocidad. Finalmente, cargue las muestras en un gel de agarosa al 0,8%. El gel de agarosa con resultados de titulación por PCR demostró que la mayoría de las bibliotecas requieren de cinco a ocho ciclos de amplificación final por PCR.
La digestión celular de la biblioteca final de PCR amplificada, observada por fragmentos más pequeños en un gel de agarosa, confirma la presencia de uniones de ligadura adecuadas y sirve como un control de calidad antes de la secuenciación. Después de la secuenciación, los datos mapeados mostraron que la combinación de DpnII y DdeI aumenta significativamente los contactos de corto alcance, como la adición de DSG a la reticulación convencional de formaldehído. También se podía observar una señal mejorada a distancias largas y cortas directamente desde matrices de interacción 2D.
Las señales de compartimento son CRISPR a largas distancias y los puntos formados por bucles de cromatina son más prominentes a distancias cortas. Además del formaldehído, la reticulación con DSG disminuye las ligaduras aleatorias, mejorando la cobertura relativa en cis. Es importante no perder células durante y después de la reticulación.
Los gránulos celulares pueden estar sueltos o ser invisibles, y las células pueden adherirse a las puntas de pipeta en algunos de los tampones.
