Nuestro protocolo utiliza análisis de comprobación de partículas únicas para monitorear la dinámica de la ubicación y la orientación y caracteriza la difusión de nanorods dorados en las membranas celulares. Con este método, se puede obtener tanto la dinámica traslacional como la dinámica de rotación de los nanorods dorados y la dinámica se puede analizar exhaustivamente y presentar. Este protocolo tiene el potencial de ser utilizado para el estudio de otros tipos de sistemas biológicos complejos.
Comience quemando un tubo de cubierta de vidrio sumergido de etanol en la llama y colocando el tubo de cubierta en un plato de cultivo celular de 35 por 10 milímetros que contiene dos mililitros de medio de cultivo celular sin fenol rojo. Agregue 50 microlitros de la suspensión celular de interés en la cubierta y agitar suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás y hacia la izquierda y la derecha para distribuir uniformemente las células. Coloque el plato en la incubadora de cultivo celular durante aproximadamente 12 horas hasta que las células alcancen entre un 20 y un 40% de confluencia antes de añadir 20 microlitros de nanorods de oro recubierto de CTAB al plato.
Después de agitar suavemente para dispersar los nanorods uniformemente a través del plato, coloque el plato en un ambiente humidificado durante cinco minutos. Al final de la incubación, transfiera lentamente 100 microlitros de sobrenadante del plato a la ranura de un tobogán de vidrio y coloque cuidadosamente el lado de la celda de la cubierta hacia abajo en la ranura del tobogán, luego selle el borde de la cubierta con esmalte de uñas y deje que el esmalte de uñas se seque antes de colocar el tobogán en el escenario del microscopio de campo oscuro. Para un solo seguimiento de partículas por microscopía de campo oscuro, coloque una gota de aceite en el condensador de campo oscuro de inmersión de aceite y gire la perilla hasta que el condensador entre en contacto con la diapositiva de vidrio.
Coloque una gota de aceite en la parte superior del vidrio de la cubierta y gire la perilla de enfoque hasta que el objetivo de inmersión de aceite 60X toque el aceite. Encienda la fuente de luz y gire ligeramente la perilla de enfoque para enfocar el plano de imágenes. A continuación, haga clic en el icono de la cámara en el software del microscopio para grabar una serie de tiempo de imagen de luz de dispersión de muestra utilizando la cámara CMOS de color y guardar la imagen en un formato TIFF.
Para extraer una sola trayectoria a largo plazo, abra la imagen en ImageJ y haga clic en imagen, escriba y de 8 bits para convertir la imagen del modo RGB al modo de 8 bits. Para ajustar el contraste, haga clic en imagen, ajuste, contraste de brillo y ajuste los parámetros. Seleccione una partícula de destino y utilice El control X para cortar el fondo de la serie temporal.
Haga clic en plugins, rastreador de partículas clásico y rastreador de partículas para abrir la ventana de detección de partículas y enlace de partículas y establecer el radio en seis, el límite en cero y el percentil en 0.01% Establezca el rango de enlace en 10 y el desplazamiento en 10 y haga clic en Aceptar para abrir la ventana de resultados del rastreador de partículas para ver los resultados. Haga clic en visualizar todas las trayectorias para inspeccionar las trayectorias generadas. Si la trayectoria generada por el software y la trayectoria móvil de los nanorods de oro coinciden, haga clic en Guardar informe completo para guardar los resultados.
Si la trayectoria generada por el software no coincide con la trayectoria móvil de los nanorods de oro, haga clic en volver a vincular las partículas para volver a vincular las partículas detectadas con diferentes parámetros de rango de enlace y percentil. Para encontrar la coordenada del píxel central del nanorod dorado en cada fotograma según la coordenada XY, utilice la xycoordination. m función.
Para delimitar una matriz de tres por tres píxeles, extraiga los nueve valores de intensidad de dispersión de los canales rojo o verde y calcule un valor medio, utilice la rgextraction. m función. Entonces usa la polarangle.
m función para calcular los ángulos polares utilizando el método diferencial de doble canal. Para calcular parámetros dinámicos utilizando las fórmulas de la tabla, ejecute los dos scripts de análisis. Para el análisis visual de la trayectoria, establezca la coordenada X como X, la coordenada Y como Y y, a continuación, la hora como Y, haga clic en trazar, dispersar y asignar a color, establezca los parámetros del gráfico y agregue la barra de colores.
Para generar cifras medias de intervalo de tiempo de desplazamiento cuadrado, establezca el intervalo de tiempo como X y el desplazamiento cuadrado medio como trazado Y.Click, dispersión, análisis, ajuste, ajuste de curva no lineal y diálogo abierto y establezca los parámetros del gráfico. Para el análisis estadístico de partículas múltiples, establezca los parámetros dinámicos de interés como Y y haga clic en trazado e histograma. Haga doble clic en el histograma para establecer el tamaño de la división o el número de divisiones y haga clic en Aplicar.
A continuación, agregue una columna y establezca los parámetros del gráfico. Para un análisis de series temporales, establezca la hora como X y los parámetros de la serie temporal como trazado Y.Click, multipanel y pila. En la ventana emergente, seleccione línea y Aceptar. A continuación, establezca los parámetros para el gráfico.
El máximo plásmido longitudinal de 40 por 85 nanómetros de nanorods de oro recubierto de CTAB es de aproximadamente 650 nanómetros y la resonancia transversal es de 520 nanómetros. La intensidad de dispersión de los nanorods de oro recubiertos de CTAB en las membranas celulares U87 demuestra una distribución gaussiana típica con un ancho estrecho consistente con el de los nanorods de oro recubiertos de CTAB en vidrio que indican que los nanorods de oro recubiertos de CTAB rastreados en este experimento están bien monodispersados. Como se ilustra, más de 500 trayectorias de nanorod de oro recubierto de CTAB pueden ser rastreadas por microscopía de campo oscuro y se pueden dividir en trayectorias de difusión de largo alcance y trayectorias de difusión confinadas.
El radio de giro de las 500 trayectorias en este análisis representativo mostró una pequeña distribución del valor con un radio medio de giro de 0,5 micrómetros y el desplazamiento máximo se distribuyó más a valores pequeños. Como se demostró en este análisis de desplazamiento cuadrado medio promedio de tiempo de conjunto, los nanorods de oro recubiertos de CTAB normalmente se difunden con un alfa de aproximadamente uno. La distribución de densidad del coeficiente de difusión y el alfa obtenido de todas las trayectorias, sin embargo, revela que la dinámica de los nanorods de oro exhibe una distribución heterogénea con movimientos de superdiffusión, browniano y subdiffusión.
Además, el análisis estadístico de partículas únicas y el análisis de parámetros de series temporales se pueden utilizar para caracterizar dos trayectorias representativas a largo plazo confinadas y móviles. Es necesario resumir y extraer una sola interpretación novedosa de los datos de la lectura del análisis de seguimiento de partículas individuales, ya que normalmente hay algunas compensaciones difíciles de hacer.
